Comparison of imported and domestic antibody kits for immunofluorescence staining of platelets in blood smears

Full Text

Наследственные нарушения тромбоцитов – это группа редких заболеваний, характеризующихся качественными дефектами тромбоцитов, часто в сочетании с количественными. Для большинства заболеваний из данной группы постановка диагноза – длительный процесс, требующий большого количества лабораторных тестов с комплексной оценкой их результатов [1–3]. Тем не менее постановка точного диагноза избавляет пациента от неоправданного применения иммуносупрессивной терапии и/или спленэктомии [4, 5].

Диагностические инструменты включают в себя функциональные и генетические тесты в сочетании с исследованием морфологических особенностей тромбоцитов. Иммуноморфологическая оценка мазков крови с помощью микроскопии представляет собой надежный метод, позволяющий диагностировать наиболее распространенные нарушения тромбоцитов [6–8]. Поскольку для приготовления мазков крови требуется минимальное количество крови, данный метод может применяться у пациентов детского возраста, в том числе у новорожденных. Метод достаточно прост и относительно дешев в исполнении. Кроме того, высушенные мазки в отличие от цельной крови могут транспортироваться, что делает диагностику доступной для удаленных регионов страны. Для ряда заболеваний иммунофлуоресцентный анализ мазков крови может обеспечить постановку диагноза сам по себе (например, MYH9-макротромбоцитопения) либо выступать дополнением для функциональных тестов, таких как агрегометрия и проточная цитометрия [8]. Данный метод можно применять для диагностики дефектов цитоскелета (MYH9, TUBB1- и FLNA- макротромбоцитопении, синдром Вискотта–Олдрича), дефицитов мембранных гликопротеинов (тромбастения Гланцмана и синдром Бернара–Сулье), а также различных дефектов a- и плотных гранул (синдром серых тромбоцитов, GATA1- и GFI1b-мутации, синдром Германски–Пудлака и т. д.). Однако метод неприменим для тромбоцитопатий, связанных с дефектами сигнальных путей [9].

В научной литературе уже есть ряд статей о том, что иммунофлуоресцентный метод анализа мазков крови может быть успешно использован для диагностики наследственных нарушений тромбоцитов [6–8, 10]. На настоящий момент отсутствуют коммерческие диагностические тест-системы для иммунофлуоресцентной оценки мазков крови пациентов с наследственными нарушениями тромбоцитов.

Цель исследования – провести сравнительный анализ наборов отечественных и импортных антител для иммунофлуоресцентного анализа мазков крови при диагностике двух наиболее распространенных нарушений тромбоцитов, связанных с дефектами мембранных гликопротеинов: тромбастении Гланцмана и синдрома Бернара–Сулье.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дизайн исследования

В ретроспективное исследование включены деперсонифицированные результаты лабораторных исследований 26 пациентов в возрасте от 1 года до 65 лет, получавших стационарную или амбулаторную помощь в условиях НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. Было 10 пациентов с установленным синдромом Бернара–Сулье и 16 – с тромбастенией Гланцмана. В качестве группы сравнения для каждой исследуемой патологии были использованы образцы крови 25 доноров отделения трансфузиологии, заготовки и процессинга гемопоэтических стволовых клеток НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева.

Критерии соответствия

Критерии включения: возраст пациента старше 1 года на момент постановки диагноза, установленные диагнозы синдрома Бернара–Сулье или тромбастении Гланцмана. Диагноз считался подтвержденным, если симптомы, наблюдаемые у пациентов, соответствовали клинической картине заболевания, описанной в литературе, а также была идентифицирована мутация либо лабораторный тест, например проточная цитометрия, подтверждал диагноз, т. е. выраженное снижение или отсутствие комплексов гликопротеина IbIX при синдроме Бернара–Сулье или гликопротеина IIbIIIa (IIbb3) при тромбастении Гланцмана.

Критерии невключения: возраст пациента младше 1 года, отсутствие установленного и подтвержденного синдрома Бернара–Сулье или тромбастении Гланцмана в соответствии с указанными выше критериями.

Условия и продолжительность исследования

Исследование выполнено на базе НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. Период включения пациентов в данное исследование – 2020–2024 гг.

Материалы

Использовались фосфатно-солевой буфер Дульбекко рН 7,2 (HiMedia); козья сыворотка; первичные антитела: мышиные анти-CD42a (Bio-Rad, клон FMC-25), анти-CD42b (Имтек), анти-CD41 (Beckman Coulter, клон P2), анти-CD41 (Имтек); кроличьи антитела к тяжелой цепи немышечного миозина IIA (анти-NMMIIA) (Sigma Aldrich); вторичные антитела: козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, меченые AF647 (Имтек), AlexaFluor568 (ThermoFisher), козьи антитела к иммуноглобулинам мыши, меченые AF488 (Имтек), AlexaFluor488 (ThermoFisher); флуоресцентная монтажная среда (Dako).

Приготовление мазков крови

Для приготовления мазков крови использовали свежую венозную кровь, взятую в вакуумные пробирки с цитратом натрия 3,2 или 3,8%. Мазки крови высушивали на воздухе при комнатной температуре в сухом месте не менее 1 сут, но не более 2 нед.

Фиксация образцов

Высушенные мазки крови фиксировали холодным ацетоном в течение 5 мин. После фиксации образцы в горизонтальном положении высушивали на воздухе до полного испарения ацетона. Зафиксированные и высушенные образцы можно использовать для иммунофлуоресцентной окраски.

Оценка связывания первичных антител

С помощью антител к СD42b (Имтек) и CD41 (Имтек), используемых в дальнейшем для создания тест-системы, было проанализировано 50 образцов мазов крови, полученных от 5 здоровых доноров (позитивный контроль), и 50 образцов мазков крови, полученных от 5 пациентов с подтвержденной патологией (отрицательный контроль), предварительно охарактеризованных с помощью мышиных анти-CD42a (Bio-Rad, клон FMC-25) и анти-CD41 (Beckman Coulter, клон P2). В качестве отрицательного контроля для антител к CD41 были использованы образцы пациентов с 1-м и 2-м типами тромбастении Гланцмана, а для анализа антител к CD41 – образцы пациентов с синдромом Бернара–Сулье с гомозиготной мутацией.

Оценка связывания вторичных антител

С использованием козьих антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с флуорофором AF488 (Имтек) было проанализировано 50 образцов мазков крови, полученных от 5 здоровых доноров с предварительно нанесенными антителами к СD41 (Имтек) (позитивный контроль), и 50 образцов мазков крови, полученных от 5 здоровых доноров без первичных антител (отрицательный контроль), предварительно охарактеризованных с помощью козьих антител к иммуноглобулинам мыши, меченых AlexaFluor488 (ThermoFisher).

Апробация набора антител в рамках клинических испытаний

Были отобраны образцы крови пациентов с подтвержденным диагнозом тромбастении Гланцмана, включая 1–3-й типы, а также образцы пациентов с синдромом Бернара–Сулье.

Для окрашивания образцов пациентов с тромбастенией Гланцмана применялись мышиные антитела анти-CD41 (Имтек). Образцы пациентов с синдромом Бернара–Сулье были проанализированы с использованием мышиных антител анти-CD42b (Имтек). Для идентификации тромбоцитов образцы дополнительно окрашивались кроличьими антителами анти-NMMIIA (Sigma Aldrich).

Оптимизация хранения образцов

Для оптимизации процедуры подготовки образцов мазков крови к длительному хранению и оценки их устойчивости при различных условиях хранения были созданы 3 группы по 50 опытных образцов. Первая группа – образцы после фиксации, которые хранились при температуре –20°С; вторая группа – образцы после фиксации, которые хранились при комнатной температуре; третья группа – образцы, упакованные в вакуумную фольгированную упаковку, которые хранились при комнатной температуре. На 0, 4, 8, 12 и 16-й неделях проводили качественную оценку в изменении окрашивания антителами к СD41 или к CD42b.

Иммунофлуоресцентное окрашивание мазков крови

Если зафиксированные образцы хранили при –20°С, то перед окрашиванием их инкубировали в горизонтальном положении в течение 30 мин при комнатной температуре и нормальной влажности. Затем проводили инкубацию с 10% козьей сывороткой в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере. После этого инкубировали образцы с первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере. После инкубации с первичными антителами образцы промывали 3 раза по 5 мин фосфатно-солевым буфером Дульбекко рН 7,2. Инкубацию со вторичными антителами проводили в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере в темноте. После инкубации со вторичными антителами образцы промывали 3 раза по 5 мин фосфатно-солевым буфером Дульбекко рН 7,2. Удаляли со стекол излишки жидкости, наносили флуоресцентную среду для заключения, закрывали покровным стеклом. Готовые образцы анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа, экспрессию интересующего белка оценивали по сравнению с нормальным контролем, окрашенным параллельно.

Для валидации первичных антител и конъюгатов вторичных антител в качестве контрольных использовали антитела зарубежного производства (анти-CD42a (Bio-Rad, клон FMC-25) и анти-CD41 (Beckman Coulter, клон P2)), об использовании которых ранее сообщалось в литературе [7].

Статистическая обработка результатов клинических испытаний

Данные, полученные в результате тестирования мазков крови от здоровых доноров и доноров с патологией, оформляли в виде таблицы сопряженности 2 × 2, при помощи которых были оценены такие параметры используемых препаратов или конъюгатов антител, как чувствительность (доля образцов мазков крови, в которых точно определяется наличие заданного белка данным тестом), специфичность (доля образцов мазков крови без заданного белка, которые точно идентифицированы тестом), прогностическая значимость положительного результата теста (доля образцов мазков крови с положительным результатом критерия, которые имеют исследуемый антиген) и прогностическая значимость отрицательного результата теста (доля образцов мазков крови с отрицательным результатом критерия, которые не имеют исследуемый антиген). На основе этих таблиц были рассчитаны величина критерия Хи-квадрат с поправкой Йетса, достигнутый уровень значимости (p) и 95% доверительный интервал для разности популяционных пропорций. Расчеты осуществлялись в программе Microsoft Excel версии 16.89.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристики исследуемой популяции

В исследование были включены 26 пациентов: 10 с синдромом Бернара–Сулье и 16 с тромбастенией Гланцмана. Общая характеристика пациентов приведена в таблице 1.

 

Таблица 1

Характеристика пациентов с наследственными тромбоцитопатиями

Table 1

Characteristics of the patients with hereditary thrombocytopathies

Патология Disorder	Общее число пациентов Total number of patients	Диагноз подтвержден лабораторными тестами The diagnosis was confirmed by laboratory tests	Диагноз подтвержден генетическими тестами The diagnosis was confirmed by genetic tests	Пол (мужской/женский) Sex (male/female)	Возраст, годы Age, years	Характерные морфологические особенности Typical morphological features
Синдром Бернара–Сулье Bernard–Soulier syndrome	10	10	7	8/2	5 (3–16)	Увеличенные тромбоциты со сниженным или полностью отсутствующим сигналом по гликопротеину IbIX Enlarged platelets with reduced or completely absent glycoprotein IbIX signal
Тромбастения Гланцмана Glanzmann thrombasthenia	16	16	3	12/4	9 (1–65)	Тромбоциты нормального размера со сниженным или полностью отсутствующим сигналом по гликопротеину IIbIIIa Platelets of normal size with reduced or completely absent glycoprotein IIbIIIa signal

 

Оценка связывания первичных антител

На рисунке 1 представлены типичные микрофотографии тромбоцитов здоровых доноров (позитивный контроль) и пациентов (негативный контроль), окрашенных исследуемыми (анти-CD41 и анти-СD42b, компания Имтек) и контрольными (анти-CD41 (Beckman Coulter, клон P2) и анти-CD42a (Bio-Rad, клон FMC-25)) антителами. Обобщенная статистика с расчетом чувствительности, специфичности, прогностичности положительного и отрицательного результатов представлена в таблицах 2–5. Отечественные антитела по своим характеристикам не уступают импортным аналогам и могут использоваться для иммунофлуоресцентного окрашивания мазков крови.

 

Рисунок 1

Оценка связывания первичных антител: мышиных анти-CD42b (панель А) и анти-СD41 (панель Б)

Приведены типичные микрофотографии тромбоцитов здоровых доноров (позитивный контроль) и пациентов (негативный контроль), окрашенных исследуемыми (анти-CD41 и анти-СD42b, компания Имтек) и контрольными (анти-CD41 (Beckman Coulter, клон P2) и анти-CD42a (Bio-Rad, клон FMC-25)) антителами

Figure 1

The assessment of primary antibody binding: mouse anti-CD42b (panel A) and anti-CD41 (panel Б)

Shows typical micrographs of platelets from healthy donors (positive control) and patients (negative control), stained with the test antibodies (anti-CD41 and anti-CD42b from Imtek company) and control antibodies (anti-CD41 (Beckman Coulter, clone P2) and anti-CD42a (Bio-Rad, clone FMC-25))

 

Таблица 2

Сравнение антител анти-CD42b (Имтек) и CD42а (Bio-Rad, клон FMC-25)

Table 2

A comparison of anti-CD42b antibodies (Imtek) and CD42a antibodies (Bio-Rad, clone FMC-25)

Показатель Parameter		Мышиные антитела анти-CD42а (Bio-Rad, клон FMC-25) Mouse anti-CD42a antibodies (Bio-Rad, clone FMC-25)		Всего Total
		Позитивный контроль Positive control	Негативный контроль Negative control
Мышиные антитела анти-CD42b (Имтек) Mouse anti-CD42b antibodies (Imtek)	Позитивный контроль Positive control	50	0	50 + 0 = 50
	Негативный контроль Negative control	0	50	0 + 50 = 0
Всего Total		50 + 0 = 50	0 + 50 = 50	50 + 0 + 0 + 50 = 100

 

Таблица 3

Данные для мышиных антител анти-CD42b (Имтек)

Table 3

Data for mouse anti-CD42b antibodies (Imtek)

Параметр Parameter	Значение Value
Чувствительность, % Sensitivity, %	100% × 50 / (50 + 0) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)
Специфичность, % Specificity, %	100% × 50 / (0 + 50) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)
Прогностичность положительного результата теста, % Positive predictive value, %	100% × 50 / (50 + 0) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)
Прогностичность отрицательного результата теста, % Negative predictive value, %	100% × 50 / (0 + 50) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)

Примечание. Здесь и в таблицах 5, 7: ДИ – доверительный интервал.

Note. Here and in tables 5, 7: CI – confidence interval.

 

Таблица 4

Сравнение антител анти-CD41 производства Имтек и Beckman Coulter

Table 4

A comparison of anti-CD41 antibodies from Imtek and Beckman Coulter

Показатель Parameter		Мышиные антитела анти-CD41 (Beckman Coulter, клон P2) Mouse anti-CD41 antibodies (Beckman Coulter, clone P2)		Всего Total
		Позитивный контроль Positive control	Негативный контроль Negative control
Мышиные антитела анти-CD41 (Имтек) Mouse anti-CD41 antibodies (Imtek)	Позитивный контроль Positive control	50	0	50 + 0 = 50
	Негативный контроль Negative control	0	50	0 + 50 = 0
Всего Total		50 + 0 = 50	0 + 50 = 50	50 + 0 + 0 + 50 = 100

 

Таблица 5

Данные для мышиных антител анти-CD41 (Имтек)

Table 5

Data for mouse anti-CD41 antibodies (Imtek)

Параметр Parameter	Значение Value
Чувствительность, % Sensitivity, %	100% × 50 / (50 + 0) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)
Специфичность, % Specificity, %	100% × 50 / (0 + 50) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)
Прогностичность положительного результата теста, % Positive predictive value, %	100% × 50 / (50 + 0) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)
Прогностичность отрицательного результата теста, % Negative predictive value, %	100% × 50 / (0 + 50) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)

 

Оценка связывания вторичных антител

На рисунке 2 показаны типичные микрофотографии тромбоцитов, окрашенных с использованием исследуемых и контрольных вторичных антител. Обобщенная статистика приведена в таблицах 6, 7. Существенных различий между отечественными и импортными антителами не выявлено.

 

Рисунок 2

Оценка связывания вторичных антител

Приведены типичные микрофотографии тромбоцитов здоровых доноров, предварительно окрашенных мышиными антителами анти-CD41 (позитивный контроль) или не окрашенных (негативный контроль). В качестве вторичных были использованы козьи антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с флуорофором AF488 (Имтек) (исследуемые антитела), и козьи антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с флуорофором AlexaFluor488 (ThermoFisher) (контрольные антитела)

Figure 2

The assessment of secondary antibody binding

Shows typical micrographs of platelets from healthy donors, either pre-stained with mouse anti-CD41 antibodies (positive control) or unstained (negative control). As secondary antibodies, goat anti-mouse immunoglobulin antibodies conjugated with the AF488 fluorophore (Imtek) (test antibodies) and goat anti-mouse immunoglobulin antibodies conjugated with the AlexaFluor488 fluorophore (ThermoFisher) (control antibodies) were used

 

Таблица 6

Сравнение вторичных антител производства Имтек и ThermoFisher

Table 6

A comparison of secondary antibodies from Imtek and ThermoFisher

Показатель Parameter		Козьи антитела к иммуноглобулинам мыши с AlexaFluor488 (ThermoFisher) Goat anti-mouse immunoglobulin antibodies with AlexaFluor488 (ThermoFisher)		Всего Total
		Позитивный контроль Positive control	Негативный контроль Negative control
Козьи антитела к иммуноглобулинам мыши с AF488 (Имтек) Goat anti-mouse immunoglobulin antibodies with AF488 (Imtek)	Позитивный контроль Positive control	50	0	50 + 0 = 50
	Негативный контроль Negative control	0	50	0 + 50 = 0
Всего Total		50 + 0 = 50	0 + 50 = 50	50 + 0 + 0 + 50 = 100

 

Таблица 7

Данные для козьих антител к иммуноглобулинам кролика с AF488 (Имтек)

Table 7

Data for goat anti-rabbit immunoglobulin antibodies with AF488 (Imtek)

Параметр Parameter	Значение Value
Чувствительность, % Sensitivity, %	100% × 50 / (50 + 0) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)
Специфичность, % Specificity, %	100% × 50 / (0 + 50) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)%)
Прогностичность положительного результата теста, % Positive predictive value, %	100% × 50 / (50 + 0) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)
Прогностичность отрицательного результата теста, % Negative predictive value, %	100% × 50 / (0 + 50) = 100% (95% ДИ/CI 100–100)

 

Апробация набора антител в рамках клинических испытаний

Как видно из рисунка 3А, тромбоциты пациентов с тромбастенией Гланцмана 1-го и 2-го типов имеют нормальные размеры и демонстрируют снижение экспрессии гликопротеина IIbIIIa. Однако для тромбастении Гланцмана 3-го типа не было выявлено существенных различий в связывании антител с гликопротеином IIbIIIa.

 

Рисунок 3

Типичные микрофотографии тромбоцитов пациентов с дефектами мембранных гликопротеинов: панель А – IIbIIIa (тромбастения Гланцмана), панель Б – IbIX (синдром Бернара–Сулье)

Для идентификации тромбоцитов были использованы антитела анти-NMMIIA (показано пурпурным цветом). Флуоресценция антител к гликопротеинам IIbIIIa (анти-CD41 (Имтек)) и IbIX (анти-CD42b (Имтек)) показана зеленым цветом. Масштаб горизонтальных отрезков, нанесенных на микрофотографии, соответствует 3 мкм

Figure 3

Shows typical micrographs of platelets from the patients with membrane glycoprotein defects: panel A – IIbIIIa (Glanzmann thrombasthenia), panel Б – IbIX (Bernard–Soulier syndrome)

Anti-NMMIIA antibodies (shown in purple) were used to identify platelets. Fluorescence of antibodies to glycoproteins IIbIIIa (anti-CD41 (Imtek)) and IbIX (anti-CD42b (Imtek)) is shown in green. The horizontal scale bars shown in the micrographs correspond to 3 µm

 

Для синдрома Бернара–Сулье (рисунок 3Б) характерны увеличенные в размерах тромбоциты, лишенные окрашивания гликопротеина IbIX.

Результаты клинических испытаний выборки пациентов с подтвержденным синдромом Бернара–Сулье и подтвержденной тромбастенией Гланцмана приведены в таблицах сопряженности (таблицы 8, 9).

 

Таблица 8

Таблица сопряженности для выборки пациентов с синдромом Бернара–Сулье

Table 8

A contingency table for a sample of patients with Bernard–Soulier syndrome

Наличие CD42+-тромбоцитов The presence of CD42⁺ platelets	Подтвержденный синдром Бернара–Сулье Confirmed Bernard–Soulier syndrome				Всего Total
	Нет (здоровый донор) No (healthy donor)		Да Yes
	Фактическая частота Observed frequency	Ожидаемая частота Expected frequency	Фактическая частота Observed frequency	Ожидаемая частота Expected frequency
Имеются Present	25	25 × 25 / 35 = 17,86	0	10 × 25 / 35 = 7,14	25
Отсутствуют (сниженная экспрессия или полное отсутствие) Absent (reduced expression or complete absence)	0	25 × 10 / 35 = 7,14	10	10 × 10 / 35 = 2,86	10
Всего Total	25	25	10	10	35
Доля пациентов с данным свойством The proportion of patients with this characteristic	25 / 25 = 1		0 / 10 = 0		(25 + 0) / 35 = 0,71

 

Таблица 9

Таблица сопряженности для выборки пациентов с тромбастенией Гланцмана

Table 9

A contingency table for a sample of patients with Glanzmann thrombasthenia

Наличие CD41+-тромбоцитов The presence of CD41⁺ platelets	Подтвержденный синдром Бернара–Сулье Confirmed Bernard–Soulier syndrome				Всего Total
	Нет (здоровый донор) No (healthy donor)		Да Yes
	Фактическая частота Observed frequency	Ожидаемая частота Expected frequency	Фактическая частота Observed frequency	Ожидаемая частота Expected frequency
Имеются Present	25	25 × 27 / 41 = 16,46	0	16 × 27 / 41 = 10,54	25
Отсутствуют (сниженная экспрессия или полное отсутствие) Absent (reduced expression or complete absence)	0	25 × 14 / 41 = 8,54	10	16 × 14 / 41 = 5,46	14
Всего Total	25	25	16	16	41
Доля пациентов с данным свойством The proportion of patients with this characteristic	25 / 25 = 1		2 / 16 = 0,125		(25 + 2) / 41 = 0,66

 

Используя данные, представленные в таблице 8, для выборки пациентов с подтвержденным синдромом Бернара–Сулье была рассчитана статистика критерия χ² Пирсона, равного 30,25, при уровне значимости p = 0,00000004. Это свидетельствует о том, что доля пациентов с нормальной экспрессией CD42⁺ не является одинаковой для исследованных выборок. Различие между группами оценивается как 100%; 95% доверительный интервал для этого различия составляет 0%.

Таким образом, получается, что сниженная экспрессия или полное отсутствие CD42⁺-тромбоцитов в мазке крови пациента почти всегда означает наличие синдрома Бернара–Сулье.

Используя данные, приведенные в таблице 9, для выборки пациентов с подтвержденной тромбастенией Гланцмана была рассчитана статистика критерия χ² Пирсона, равного 29,47. Расчетное значение p для данной величины критерия χ² составляет 0,00000006. Это свидетельствует о том, что существует достоверное различие между здоровыми людьми и пациентами с тромбастенией Гланцмана по наличию или отсутствию CD41⁺-тромбоцитов в исследуемых образцах мазков крови. Мы оцениваем это различие как 100% – 12,5% = 87,5%; 95% доверительный интервал для истинного различия в этих двухпроцентных отношениях составляет от 71,4 до 100%.

Таким образом, можно сделать вывод, что снижение экспрессии или полное отсутствие CD41⁺-тромбоцитов в мазке крови пациента с высокой вероятностью (87%) указывает на наличие тромбастении Гланцмана.

Опытное хранение образцов мазков крови

При хранении образцов в течение 16 нед наиболее выраженные изменения при окрашивании анти-CD42b наблюдаются в образцах, хранящихся при комнатной температуре без вакуумной упаковки (рисунок 4). В данных образцах к 16-й неделе существенно снижается интенсивность окраски анти-CD42b. В остальных случаях (хранение при –20°С, в вакуумной фольгированной упаковке при комнатной температуре) существенных изменений в окраске гликопротеина IbIX антителами анти-CD42b в течение 16 нед не наблюдается.

 

Рисунок 4

Изменение в окрашивании гликопротеина IbIX антителами анти-CD42b (Имтек) при хранении фиксированных образцов в различных условиях

Красной рамкой выделена микрофотография с выраженным снижением интенсивности флуоресценции анти-CD42b. Масштаб горизонтальных отрезков, нанесенных на микрофотографии, соответствует 10 мкм. RT – комнатная температура

Figure 4

The changes in glycoprotein IbIX staining with anti-CD42b antibodies (Imtek) during the storage of fixed samples under various conditions

The micrograph outlined in red shows a marked decrease in anti-CD42b fluorescence intensity. The horizontal scale bars shown in the micrographs correspond to 10 μm. RT – room temperature

 

При хранении образцов в течение 16 нед наиболее выраженные изменения при окрашивании анти-CD41 наблюдаются в образцах, хранящихся при комнатной температуре без вакуумной фольгированной упаковки (рисунок 5). В данных образцах к 16-й неделе хранения наблюдается существенное снижение окрашивания гликопротеина IIbIIIa антителами анти-CD41. В остальных случаях (хранение при –20°С, в вакуумной фольгированной упаковке при комнатной температуре) существенных изменений в окраске гликопротеина IIbIIIa антителами анти-CD41 в течение 16 нед не наблюдается.

 

Рисунок 5

Изменение в окрашивании гликопротеина IIbIIIa антителами анти-CD41 (Имтек) при хранении фиксированных образцов в различных условиях

Красной рамкой выделена микрофотография с выраженным снижением интенсивности флуоресценции анти-CD41. Масштаб горизонтальных отрезков, нанесенных на микрофотографии, соответствует 10 мкм. RT – комнатная температура

Figure 5

The changes in glycoprotein IIbIIIa staining with anti-CD41 antibodies (Imtek) during the storage of fixed samples under various conditions

The micrograph outlined in red shows a marked decrease in anti-CD41 fluorescence intensity. The horizontal scale bars shown in the micrographs correspond to 10 μm. RT – room temperature

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе работы было проведено качественное сравнение отечественных антител с импортными аналогами, о применении которых для иммунофлуоресцентного окрашивания мазков крови ранее сообщалось в литературе [6, 7, 11]. В первую очередь были оценены чувствительность и специфичность первичных антител к поверхностным гликопротеинам тромбоцитов: IIbIIIa (CD41) и IbIX (CD42), а также соответствующих вторичных флуоресцентно меченых антител. Результаты исследования показали, что исследуемые отечественные антитела не уступают импортным аналогам. Это открывает возможность для создания на их основе тест-системы для диагностики двух наиболее распространенных наследственных патологий тромбоцитов, связанных с дефицитом поверхностных гликопротеинов: тромбастении Гланцмана (дефицит гликопротеина IIbIIIa) и синдрома Бернара–Сулье (дефицит гликопротеина IbIX).

Кроме того, мы провели испытания разработанной тест-системы для диагностики вышеупомянутых патологий. Результаты показали, что у всех пациентов (n = 10) с подтвержденным синдромом Бернара–Сулье экспрессия гликопротеина IbIX была снижена или отсутствовала полностью. Следует отметить, что необходимо продолжить клинические испытания, чтобы увеличить число пациентов. В литературе есть данные о том, что для некоторых пациентов с гетерозиготной формой мутации в гене, кодирующем гликопротеин IbIX, постановка диагноза с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания мазков крови может быть затруднительной [7]. В нашей выборке только 1 пациент имел гетерозиготную форму мутации, и даже для него мы смогли однозначно продемонстрировать снижение экспрессии гликопротеина IbIX.

Из 16 пациентов с подтвержденной тромбастенией Гланцмана только у 2 (13%) не удалось выявить снижение или отсутствие экспрессии гликопротеина IIbIIIa. У этих пациентов была диагностирована тромбастения Гланцмана 3-го типа. В данном случае проблема заключалась не в количестве или отсутствии гликопротеина IIbIIIa, а в его функциональной несостоятельности. Количество гликопротеина было в норме, что подтверждалось мазками крови и цитометрией. Однако рецептор не выполнял свои функции должным образом.

Полученные в рамках этой работы данные о клинической применимости иммунофлуоресцентного анализа мазков крови для диагностики тромбастении Гланцмана и синдрома Бернара–Сулье совпадают с опубликованными ранее результатами командой профессора Грайнахера [12].

Не менее важным аспектом при создании диагностических тест-систем являются правильная подготовка проб и обеспечение их сохранности во время хранения и транспортировки. Наглядно показано, что образцы мазков крови остаются стабильными для оценки экспрессии как гликопротеина IbIX, так и гликопротеина IIbIIIa в течение как минимум 16 нед при температуре –20°С. А если поместить образцы в герметичную вакуумную фольгированную упаковку, то температуру хранения можно увеличить до 20–25°С. Это значительно упрощает транспортировку мазков крови из регионов России, где не всегда есть возможность оперативно провести подобную диагностику.

Ограничения исследования

Ключевым ограничением данного исследования является небольшая выборка пациентов с наследственными тромбоцитопатиями, что представляет собой объективную трудность при изучении редких патологий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведена валидация набора первичных и вторичных антител к гликопротеинам тромбоцитов IIbIIIa (CD41) и IbIX (CD42). Показана высокая диагностическая точность метода иммунофлуоресцентного анализа мазков крови с использованием данных реагентов: для синдрома Бернара–Сулье 100% совпадение с клиническим диагнозом, а для тромбастении Гланцмана чувствительность метода составила 87%. Кроме того, показана возможность хранения зафиксированных мазков крови в течение 16 нед при температуре –20°С или 20–25°С в герметичной вакуумной фольгированной упаковке.

ЭТИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА

В ретроспективное исследование включены деперсонифицированные результаты лабораторных исследований пациентов, поэтому оно не требовало одобрения независимого этического комитета.

ETHICS REVIEW

This retrospective study included depersonalized laboratory test results of the patients; therefore, it did not require approval from an Independent Ethics Committee.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа поддержана грантом Российского научного фонда №24-15-00387 «От физиологии тромбоцита к инновационным методам лабораторной диагностики».

FUNDING

The work was supported by the Russian Science Foundation grant No. 24-15-00387 “From platelet physiology to innovative methods of laboratory diagnosis”.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

CONFLICT OF INTEREST

The authors of the article confirm that there is no conflict of interest to declare.

ВКЛАД АВТОРОВ

Н.А. Подоплелова, Е.О. Осидак: разработка дизайна статьи, анализ данных, написание и редактирование текста;

П.А. Жарков: пересмотр и редактирование текста;

Е.В. Юшкова, Д.Б. Флоринский, Д.В. Федорова, Д.М. Полохов: сбор и анализ данных.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

N.A. Podoplelova, E.O. Osidak: article design, data analysis, manuscript writing and editing;

P.A. Zharkov: manuscript revision and editing;

E.V. Yushkova, D.B. Florinskiy, D.V. Fedorova, D.M. Polokhov: data collection and analysis.

About the authors

Nadezhda A. Podoplelova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: podoplelovan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8013-1112

PhD, a leading researcher at the Laboratory of Cell Hemostasis and Thrombosis of the Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Russian Federation, Moscow; Moscow

E. V. Yushkova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Email: podoplelovan@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0007-3456-9616
Russian Federation, Moscow; Moscow

D. B. Florinskiy

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: podoplelovan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4555-9337
Russian Federation, Moscow

D. V. Fedorova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: podoplelovan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4567-1871
Russian Federation, Moscow

D. M. Polokhov

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: podoplelovan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6905-2878
Russian Federation, Moscow

P. A. Zharkov

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: podoplelovan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4384-6754
Russian Federation, Moscow

E. O. Osidak

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: podoplelovan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2549-4011
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files