Mechanisms of the stimulatory effect of neutrophil extracellular traps on blood clot retraction

Full Text

Воспалительный тромбоз патогенетически связывает между собой иммунную систему и систему гемостаза, играя важную роль в патогенезе многих воспалительных заболеваний различной этиологии. Инфекционные и другие иммуноопосредованные болезни широко распространены в нашей стране и во всем мире, являясь частой причиной инвалидизации и смерти пациентов [1, 2]. Тромбоз является угрожающим жизни состоянием при тяжелых инфекциях [3, 4], а также при многих аутоиммунных заболеваниях, при которых тромбоэмболические осложнения наблюдаются в несколько раз чаще, чем в общей популяции [5–7]. Иммунный тромбоз ассоциирован с активацией нейтрофилов и моноцитов, способствующих тромбообразованию, благодаря экспрессии и секреции прокоагулянтов, а также образованию нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ, neutrophil extracellular traps) [8]. Показано, что НВЛ способны усиливать как свертывание крови, так и локальные воспалительные реакции [9].

Важным патогенетическим механизмом тромбоза является процесс сжатия (ретракции) внутрисосудистого сгустка крови, который вызывается активированными тромбоцитами. Феномен ретракции сгустка отражает функциональную активность тромбоцитов и наблюдается не только in vitro [10], но и in vivo [11, 12], модулируя свойства прижизненных гемостатических сгустков и особенно тромбов. К таким свойствам относятся обструктивность тромбов, их проницаемость для фибринолитических ферментов, механическая жесткость и эмбологенность (устойчивость к разрыву), что в совокупности влияет на клиническое течение и исходы тромбоза [13]. Несмотря на клиническую значимость, взаимосвязь между ретракцией сгустков крови и воспалением изучена недостаточно.

Учитывая, что сжатие сгустка крови зависит от его клеточного состава [14], и принимая во внимание накопление нейтрофилов в составе воспалительных тромбов, ранее мы исследовали влияние активированных нейтрофилов на ретракцию сгустков крови [15]. Оказалось, что добавление в кровь активированных нейтрофилов сопровождается ускорением и усилением ретракции сгустков крови, и этот эффект тесно связан с внеклеточным деконденсированным ядерным хроматином (структурной основой НВЛ), встроенным в фибриновую сеть, которая образует механический каркас сгустка.

Цель исследования – изучение механизмов стимулирующего влияния активированных нейтрофилов, прежде всего НВЛ, на скорость и степень ретракции сгустков крови, опосредованной тромбоцитами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение крови и ее компонентов

Для модельных экспериментов in vitro кровь была получена у 30 доноров, не принимавших антикоагулянты в течение 2 нед до взятия крови. Венозную кровь собирали в вакутейнеры (Vacuette, Greiner Bio-one), стабилизируя 3,2% цитратом натрия в соотношении 9:1 по объему. Богатую тромбоцитами плазму (platelet-rich plasma, PRP) получали центрифугированием крови при 200g в течение 10 мин. Часть крови была использована для выделения нейтрофилов.

Выделение и активация нейтрофилов для получения нейтрофильных внеклеточных ловушек

Для выделения нейтрофилов 5 мл цитратной крови наслаивали на 5 мл среды для разделения клеток Lympholyte-Poly (Cedarlane) и центрифугировали при 500g в течение 35 мин. Собирали белое кольцо нейтрофилов и трижды промывали клетки буфером Хэнкса (HBSS), не содержащим ионы Ca²⁺ и Mg²⁺, ресуспендируя и центрифугируя при 300g в течение 10 мин. Отмытые клетки ресуспендировали в 250 мкл HBSS. Число клеток определяли с помощью световой микроскопии в камере Горяева. Для образования НВЛ часть выделенных нейтрофилов активировали добавлением 100 нМ (конечная концентрация) форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА) и инкубировали 3,5 ч при 37^ºC в CO₂-инкубаторе (New Brunswick Galaxy 170R, Marshall Scientific). Суспензию ФМА-активированных нейтрофилов использовали как источник НВЛ.

Метод изучения ретракции сгустков крови или плазмы

Ретракцию сгустков в цельной цитратной крови человека или PRP регистрировали оптически по уменьшению размера сгустка в присутствии неактивированных или активированных нейтрофилов. Кинетику ретракции сгустка отслеживали с помощью «Регистратора тромбодинамики» (ООО «ГемаКор»). Для изучения эффектов неактивированных или активированных нейтрофилов 60–80 мкл HBSS, содержащего ~8 × 10⁵ нейтрофилов, добавляли к 120–140 мкл крови или PRP до конечного объема 200 мкл. Образцы активировали добавлением 2 мМ CaCl₂ и 1 МЕ/мл человеческого тромбина (Sigma-Aldrich) (конечные концентрации). Перед формированием сгустка активированные образцы крови или плазмы (80 мкл) переносили в прозрачные пластиковые кюветы, которые предварительно ополаскивали детергентом. Кювету помещали при 37^ºC в камеру оптического анализатора. Изображения сгустков в процессе сжатия получали каждые 15 с в течение 20 мин. Серийные изображения анализировали с помощью компьютерной программы для построения кинетической кривой ретракции сгустка и извлечения кинетических параметров, описанных ранее [16].

Тромбоэластография

Тромбоэластограммы регистрировали с использованием прибора TEG 5000 (Haemoscope). Образцы цитратной крови или PRP смешивали либо с физиологическим раствором (контроль), либо с выделенными нейтрофилами (неактивированными или ФМА-активированными). Затем добавляли CaCl₂ (конечная концентрация 2 мМ) и человеческий тромбин (Sigma-Aldrich) (конечная концентрация 1 МЕ/мл), после чего 360 мкл смеси быстро переносили в предварительно нагретую до 37^ºC кювету и начинали измерение. После регистрации тромбоэластограммы определяли следующие параметры: R – время реакции (время от начала свертывания до начала формирования фибрина) и G – модуль упругости (эластический модуль) сгустка, рассчитанный из максимальной амплитуды (MA) в миллиметрах согласно формуле производителя:

G (дин/см²) = 5000 × MA / (100 – MA).

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием пакета программ GraphPad Prism 10 (GraphPad Software). Нормальность распределения данных оценивали с помощью критериев Шапиро–Уилка и Д’Агостино–Пирсона. Парные статистические различия оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента (параметрический анализ) и U-критерия Манна–Уитни или критерия Уилкоксона (непараметрический анализ). Статистические различия для множественных сравнений оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным тестом Сидака. Уровень значимости составлял 95% (p < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Кинетика ретракции сгустка в присутствии активированных и неактивированных нейтрофилов

Ранее было показано, что ретракция сгустка крови во времени протекает в 3 фазы: инициация ретракции (фаза 1), линейная ретракция (фаза 2) и механическая стабилизация сгустка (фаза 3) [14]. Мы провели фазовый анализ индивидуальных кинетических кривых ретракции сгустка в цельной крови и PRP, представленных на рисунке 1, после усреднения.

 

Рисунок 1

Сравнительный фазовый анализ усредненных кинетических кривых ретракции сгустков, образованных в цельной крови (А) и PRP (Б), в присутствии неактивированных и ФМА-активированных нейтрофилов

Образование и ретракцию сгустка инициировали добавлением 1 МЕ/мл тромбина с последующей оптической регистрацией размера сгустка во времени. На усредненных кинетических кривых переходы между фазами ретракции (вертикальные сплошные линии) определяли путем нахождения локальных максимумов и минимумов в мгновенных первых производных (пунктирные кривые). Кинетические кривые аппроксимировали с помощью кусочной функции, определяли длительность и константу скорости каждой фазы. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5 – для цельной крови и n = 4 – для PRP, полученных из крови независимых доноров)

Figure 1

A comparative phase analysis of the averaged kinetic curves of clot retraction in whole blood (А) and platelet-rich plasma (PRP) (Б) in the presence of non-activated and PMA-activated neutrophils

Clot formation and retraction were induced by the addition of 1 IU/mL of thrombin, then optical tracking of clot size was performed. On the averaged kinetic curves transitions between the phases of retraction (vertical solid lines) were determined by finding local maxima and minima within the instantaneous first derivatives (dashed curves). The kinetic curves were approximated using a piecewise function, and the duration and rate constant of each phase were determined. The results are presented as the mean ± standard deviation (n = 5 for whole blood and n = 4 for PRP obtained from independent donors)

 

В сгустках, полученных как в цельной крови, так и в PRP, продолжительность фазы инициации (фаза 1) достоверно увеличивалась в присутствии ФМА-активированных нейтрофилов (таблица 1, рисунок 1). Этот результат подчеркивает определяющую роль реакций фазы 1 в общем усилении ретракции сгустка активированными нейтрофилами, показанном ранее [15]. Учитывая, что фаза инициации отражает активацию тромбоцитов под действием тромбина, как экзогенного, так и эндогенного, наблюдаемое удлинение фазы 1 в присутствии ФМА-активированных нейтрофилов косвенно указывает на усиленную, нарастающую во времени генерацию эндогенного тромбина и пролонгированную дополнительную активацию тромбоцитов.

 

Таблица 1

Кинетический фазовый анализ (длительность и константа скорости фазы) ретракции сгустков, образованных в цельной крови и PRP

Table 1

A kinetic phase analysis (duration and rate constant of each phase) of clot retraction in whole blood and PRP

Фаза Phase	Длительность, с Duration, s		Значения p p-values	Константа скорости, 1/с Rate constant, 1/s		Значения p p-values
	Неактивированные нейтрофилы Non-activated neutrophils	Активированные нейтрофилы Activated neutrophils		Неактивированные нейтрофилы Non-activated neutrophils	Активированные нейтрофилы Activated neutrophils
Цельная кровь Whole blood
1	45 ± 39	98 ± 34	0,02	0,04 ± 0,06	0,02 ± 0,01	0,8
2	132 ± 47	129 ± 70	0,9	0,10 ± 0,02	0,07 ± 0,02	0,002
3	1023 ± 32	999 ± 88	0,4	0,005 ± 0,001	0,003 ± 0,001	0,0002
PRP
1	23 ± 11	47 ± 8	0,02	Неизмеримо Immeasurable	0,39 ± 0,33	–
2	105 ± 8	126 ± 40	0,2	0,16 ± 0,03	0,15 ± 0,06	0,6
3	1073 ± 8	1028 ± 42	0,03	0,005 ± 0,001	0,004 ± 0,001	0,004

Примечание. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5 – для цельной крови, n = 4 – для PRP, полученных из крови независимых доноров). Для сгустков из цельной крови использовали критерий Уилкоксона (непараметрический) для фазы 1 и парный t-критерий Стьюдента (параметрический) для фаз 2 и 3. Для сгустков из PRP использовали критерий Уилкоксона (непараметрический) для длительностей и парный t-критерий Стьюдента (параметрический) для констант скорости.

Notes. The results are presented as the mean ± standard deviation (n = 5 for whole blood, n = 4 for PRP obtained from independent donors). For whole blood clots, we used the Wilcoxon (non-parametric) test for phase 1 and the Student’s paired (parametric) t-test for phases 2 and 3. For PRP clots, we used the Wilcoxon (non-parametric) test for phase durations and the Student’s paired (parametric) t-test for rate constants.

 

В отличие от фазы 1 ретракции сгустков в присутствии активированных нейтрофилов продолжительность фаз 2 и 3 имела тенденцию к уменьшению при одновременном увеличении скорости (таблица 1). Поскольку фазы 2 и 3 в значительной степени являются механическими, т. е. отражают прогрессирующую компрессию сгустка и его механическую стабилизацию [14], наблюдаемые отличия в продолжительности и скорости этих фаз в присутствии активированных нейтрофилов косвенно свидетельствуют об изменениях механических свойств фибрина.

Таким образом, сравнительный кинетический анализ ретракции сгустков дал основания предположить вероятные механизмы, лежащие в основе стимулирующего влияния активированных нейтрофилов и НВЛ на ретракцию сгустка. Последующие разделы содержат прямые экспериментальные доказательства этих механизмов.

Стимулирующий эффект нейтрофильных внеклеточных ловушек на ретракцию сгустка опосредован усиленным образованием эндогенного тромбина

Удлинение фазы инициации под влиянием активированных нейтрофилов (рисунок 1) наводит на мысль о том, что причиной усиления сжатия сгустка крови НВЛ является увеличение продукции эндогенного тромбина, что вызывает вторичную гиперактивацию тромбоцитов, включая повышение сократительной активности. В целях проверки этого предположения мы проводили эксперименты в присутствии ривароксабана – ингибитора фактора Xa, способного предотвращать образование эндогенного тромбина. Перед формированием сгустка и его ретракцией ривароксабан добавляли к образцам цельной крови (таблица 2, рисунок 2) или PRP (таблица 3, рисунок 3), содержащим неактивированные или ФМА-активированные нейтрофилы. В отличие от контрольных образцов цельной крови, содержащих неактивированные нейтрофилы, в присутствии ФМА-активированных нейтрофилов ривароксабан достоверно понижал конечную степень сжатия сгустков, площадь под кинетической кривой и среднюю скорость ретракции (таблица 2, рисунок 2А, В, Г). Схожие эффекты наблюдались в PRP: в присутствии ривароксабана средняя скорость и конечная степень ретракции сгустка достоверно снижались при добавлении ФМА-активированных нейтрофилов, в то время как в присутствии неактивированных нейтрофилов ривароксабан не оказывал влияния (таблица 3, рисунок 3А, Г).

 

Таблица 2

Влияние ривароксабана на ретракцию сгустков в цельной крови с добавлением неактивированных или ФМА-активированных нейтрофилов

Table 2

The effect of rivaroxaban on clot retraction in whole blood in the presence of non-activated or PMA-activated neutrophils

Параметры ретракции сгустка Clot retraction parameters	Неактивированные нейтрофилы Non-activated neutrophils	С добавлением ривароксабана + Rivaroxaban	ФМА-активированные нейтрофилы PMA-activated neutrophils	С добавлением ривароксабана + Rivaroxaban
Конечная степень ретракции, % Final extent of clot retraction, %	48 ± 5	42 ± 5	55 ± 3	39 ± 4
Значение p p-value	0,08		0,003
Лаг-период, с Lag time, s	93 ± 40	76 ± 29	34 ± 18	43 ± 15
Значение p p-value	0,6		0,3
Площадь под кинетической кривой, у. е. Area under the kinetic curve, a. u.	388 ± 48	347 ± 37	425 ± 41	312 ± 45
Значение p p-value	0,2		0,02
Средняя скорость, %/с Average rate, %/s	0,039 ± 0,003	0,034 ± 0,003	0,039 ± 0,003	0,032 ± 0,003
Значение p p-value	0,07		0,03

Примечание. Здесь и в таблицах 3, 5: результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5). Парный t-критерий Стьюдента.

Notes. Here and in Tables 3 and 5: the results are presented as the mean ± SD (n = 5). The Student’s paired t-test.

 

Рисунок 2

Влияние ривароксабана на параметры ретракции сгустка в цельной крови в присутствии неактивированных или ФМА-активированных нейтрофилов

Образование и ретракцию сгустка инициировали добавлением 1 МЕ/мл тромбина с последующей оптической регистрацией размера сгустка во времени. Конечная степень ретракции (А), лаг-период (Б), площадь под кривой (В), средняя скорость (Г) измерялись в сгустках, сформированных в образцах цельной крови, полученной от независимых доноров. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5). Для сравнения средних значений использовали парный t-критерий Стьюдента

Figure 2

The effect of rivaroxaban on the parameters of clot retraction in whole blood in the presence of non-activated or PMA-activated neutrophils

Clot formation and retraction were induced by the addition of 1 IU/mL of thrombin, then optical tracking of clot size was performed. The final extent of clot retraction (А), lag time (Б), area under the curve (В), and average rate (Г) were measured in clots formed in whole blood samples from independent donors. The results are presented as the mean ± standard deviation (n = 5). The Student’s paired t-test was used to compare the average values

 

Таблица 3

Влияние ривароксабана на ретракцию сгустков в PRP с добавлением неактивированных или ФМА-активированных нейтрофилов

Table 3

The effect of rivaroxaban on clot retraction in PRP in the presence of non-activated or PMA-activated neutrophils

Параметры ретракции сгустка Clot retraction parameters	Неактивированные нейтрофилы Non-activated neutrophils	С добавлением ривароксабана + Rivaroxaban	ФМА-активированные нейтрофилы PMA-activated neutrophils	С добавлением ривароксабана + Rivaroxaban
Конечная степень ретракции, % Final extent of clot retraction, %	83 ± 3	81 ± 4	86 ± 3	65 ± 3
Значение p p-value	0,4		0,001
Лаг-период, с Lag time, s	112 ± 23	118 ± 18	129 ± 38	121 ± 68
Значение p p-value	0,6		0,5
Площадь под кинетической кривой, у. е. Area under the kinetic curve, a. u.	676 ± 140	709 ± 56	709 ± 82	577 ± 128
Значение p p-value	0,7		0,1
Средняя скорость, %/с Average rate, %/s	0,068 ± 0,002	0,067 ± 0,003	0,072 ± 0,010	0,057 ± 0,013
Значение p p-value	0,4		0,053

 

Рисунок 3

Влияние ривароксабана на параметры ретракции сгустка в PRP в присутствии неактивированных или ФМА-активированных нейтрофилов

Образование и ретракцию сгустка инициировали добавлением 1 МЕ/мл тромбина с последующей оптической регистрацией размера сгустка во времени. Конечная степень ретракции (А), лаг-период (Б), площадь под кривой (В), средняя скорость (Г) измерялись в сгустках, сформированных в образцах PRP, полученной от независимых доноров. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5). Для сравнения средних значений использовали парный t-критерий Стьюдента

Figure 3

The effect of rivaroxaban on clot retraction parameters in PRP in the presence of non-activated or PMA-activated neutrophils

Clot formation and retraction were induced by the addition of 1 IU/mL of thrombin, then optical tracking of clot size was performed. The final extent of clot retraction (A), lag time (Б), area under the curve (В), and average rate (Г) were measured in clots formed in PRP samples from independent donors. The results are presented as the mean ± standard deviation (n = 5). The Student’s paired t-test was used to compare the average values

 

Таким образом, подавление генерации эндогенного тромбина путем ингибирования фактора Xa устраняет стимулирующий эффект НВЛ на ретракцию сгустка. Полученные результаты указывают на то, что в присутствии ФМА-активированных нейтрофилов, продуцирующих НВЛ, усиленное сжатие сгустка обусловлено повышенной продукцией эндогенного тромбина, который дополнительно активирует тромбоциты, усиливая их сократительный потенциал.

Стимулирующий эффект нейтрофильных внеклеточных ловушек на ретракцию сгустка опосредован размягчением сгустка

Исходя из различной кинетики механических стадий ретракции в фазах 2 и 3 (таблица 1, рисунок 1), альтернативный гипотетический механизм стимулирующего эффекта ФМА-активированных нейтрофилов на ретракцию сгустка – это влияние НВЛ на механические свойства сгустка или точнее – на его деформируемость. В целях проверки этого предположения мы исследовали динамическую эластичность сгустка с помощью тромбоэластографии (ТЭГ), которая регистрирует изменения жесткости сгустка во времени в ответ на напряжение сдвига. В дополнение ко времени свертывания крови (R, с) ТЭГ характеризует механические свойства сгустка, в частности его максимальную твердость (firmness) (MA, мм), которую можно преобразовать в абсолютный параметр – эластичность сгустка (G, Па). Мы изучили влияние ФМА-активированных и неактивированных нейтрофилов на время свертывания и эластичность сгустка в цельной крови и PRP. В сгустках из цельной крови не было выявлено заметного влияния ФМА-активированных нейтрофилов на параметры ТЭГ (таблица 4, рисунок 4А, Б), в то время как в сгустках из PRP НВЛ несколько удлиняли время свертывания и, что наиболее важно, снижали конечную жесткость сгустка (таблица 4, рисунок 4В, Г), это указывает на то, что НВЛ делают сгусток более мягким, т. е. податливым для деформации.

 

Таблица 4

Параметры тромбоэластограммы в отсутствии (контроль) и присутствии неактивированных или ФМА-активированных нейтрофилов

Table 4

Thromboelastography parameters in the absence (control) and presence of non-activated and PMA-activated neutrophils

Параметры тромбоэластограммы Thromboelastography parameters	Контроль (без добавления нейтрофилов) Control (no added neutrophils)	Неактивированные нейтрофилы Non-activated neutrophils	ФМА-активированные нейтрофилы PMA-activated neutrophils	Значение p p-value
Цельная кровь Whole blood
R, мин R, min	2,1 ± 0,5	1,9 ± 0,6	2,3 ± 0,7	0,7
G, Па G, Pa	341 ± 119	498 ± 220	336 ± 173	0,3
PRP
R, мин R, min	1,2 ± 0,3	1,0 ± 0,2	1,2 ± 0,1	0,3
G, Па G, Pa	931 ± 190	1225 ± 236	807 ± 274	0,04

Примечание. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5). ANOVA.

Notes. The results are presented as the mean ± standard deviation (n = 5). One-way ANOVA test.

 

Рисунок 4

Параметры тромбоэластограммы R и G, измеренные в отсутствии (контроль) и присутствии неактивированных или ФМА-активированных нейтрофилов

Образование и ретракцию сгустка инициировали добавлением 1 МЕ/мл тромбина в цельной крови (А, Б) или PRP (В, Г), полученных от независимых доноров. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5). ANOVA

Figure 4

Thromboelastography parameters R (the reaction time) and G (clot elastic modulus) measured in the absence (control) and presence of non-activated or PMA-activated neutrophils

Clot formation and retraction were induced by the addition of 1 IU/mL of thrombin in whole blood (А, Б) or PRP (В, Г) obtained from independent donors. The results are presented as the mean ± standard deviation (n = 5). One-way ANOVA test

 

Обнаруженная связь между жесткостью сгустка и наличием НВЛ была подтверждена с помощью ДНКазы I, чтобы оценить, как расщепление НВЛ под действием этого фермента изменит параметры ТЭГ в цельной крови и PRP в присутствии ФМА-активированных нейтрофилов. Перед инициацией свертывания и регистрацией ТЭГ образцы крови или PRP смешивали с необработанными или ФМА-активированными нейтрофилами с последующим добавлением ДНКазы I и инкубацией в течение 30 мин при 37°C (таблица 5, рисунок 5). Обработка ДНКазой I увеличивала среднее значение параметра G в сгустках из цельной крови с ФМА-активированными нейтрофилами, что указывает на ключевую роль НВЛ в уменьшении жесткости сгустка. Напротив, в образцах крови, содержащих неактивированные нейтрофилы, эффект ДНКазы I отсутствовал (таблица 5, рисунок 5Б). В отличие от цельной крови в PRP добавление ДНКазы I не влияло на параметры ТЭГ (таблица 5, рисунок 5В, Г), что, вероятно, связано со значительно большей жесткостью PRP-сгустков, характеризующихся бóльшим содержанием фибрина по сравнению со сгустками из цельной крови, что отчетливо видно по максимальным значениям параметра G на осях Y на рисунке 5Б, Г.

 

Таблица 5

Влияние ДНКазы I на параметры тромбоэластограммы в отсутствии (контроль) и присутствии неактивированных или ФМА-активированных нейтрофилов в цельной крови и PRP

Table 5

The effect of DNase I on thromboelastography parameters in the absence (control) and presence of non-activated or PMA-activated neutrophils in whole blood and in PRP

Параметры тромбоэластограммы Thromboelastography parameters	Контроль (без добавления нейтрофилов) Control (no added neutrophils)	С добавлением ДНКазы I + DNase I	Неактивированные нейтрофилы Non-activated neutrophils	С добавлением ДНКаза I + DNase I	ФМА-активированные нейтрофилы PMA-activated neutrophils	С добавлением ДНКазы I + DNase I
Цельная кровь Whole blood
R, мин R, min	2,1 ± 0,5	1,5 ± 0,8	1,9 ± 0,6	1,5 ± 0,4	2,3 ± 0,7	1,6 ± 0,4
Значение p p-value	0,1		0,1		0,03
G, Па G, Pa	341 ± 119	547 ± 231	498 ± 220	633 ± 327	336 ± 173	481 ± 180
Значение p p-value	0,3		0,2		0,01
PRP
R, мин R, min	1,2 ± 0,3	0,9 ± 0,1	1,0 ± 0,2	0,9 ± 0,2	1,2 ± 0,1	1,1 ± 0,2
Значение p p-value	0,1		0,7		0,2
G, Па G, Pa	931 ± 190	868 ± 271	1225 ± 236	916 ± 489	807 ± 274	977 ± 243
Значение p p-value	0,5		0,2		0,4

 

Рисунок 5

Влияние ДНКазы I на параметры тромбоэластограммы R и G в отсутствии (контроль) и присутствии неактивированных или ФМА-активированных нейтрофилов

Образование и ретракцию сгустка инициировали добавлением 1 МЕ/мл тромбина в цельной крови (А, Б) или PRP (В, Г), полученных от независимых доноров. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5). Для сравнения использовали парный t-критерий Стьюдента

Figure 5

The effect of DNase I on thromboelastography parameters R and G in the absence (control) and presence of non-activated or PMA-activated neutrophils

Clot formation and retraction were induced by the addition of 1 IU/mL of thrombin in whole blood (А, Б) or PRP (В, Г) obtained from independent donors. The results are presented as the mean ± standard deviation (n = 5). The Student’s paired t-test was used for comparison

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Воспалительный тромбоз является тяжелым осложнением заболеваний различной этиологии. Клиническое течение и исходы иммунотромбоза во многом определяются составом и динамическими свойствами тромба. К таким свойствам тромба относятся его механическая устойчивость, проницаемость и чувствительность к лизису, которые, в свою очередь, в значительной степени зависят от полноты сжатия, или ретракции.

Ранее мы описали усиление ретракции сгустков крови под действием активированных нейтрофилов и показали, что стимулирующий эффект нейтрофилов на ретракцию связан с образованием НВЛ [15]. В данной работе, направленной на определение механизмов этого явления, мы установили, по крайней мере, 2 независимых пути, посредством которых НВЛ усиливают ретракцию сгустка крови, а именно увеличение локальной продукции эндогенного тромбина и влияние на механические свойства сгустков.

Известно, что комплексы гистонов и ДНК, образующих структурную основу НВЛ, обладают прокоагулянтными свойствами и стимулируют выработку тромбина посредством различных механизмов [17, 18]. Поскольку тромбин является мощным агонистом тромбоцитов, усиливающим их сократительную активность [14, 19, 20], мы предположили, что ингибирование НВЛ-индуцированной локальной генерации тромбина внутри сгустка уменьшит или устранит стимулирующий эффект активированных нейтрофилов на ретракцию сгустка. Действительно, в присутствии ривароксабана (ингибитор фактора Xa) скорость и степень ретракции сгустка при ФМА-активированных нейтрофилах были снижены до уровня контроля с неактивированными нейтрофилами (рисунки 2А, В, Г, 3А, Г). Этот результат убедительно свидетельствует в пользу усиленной выработки эндогенного тромбина как механизма, способствующего ретракции воспалительных тромбов под влиянием НВЛ. Это наблюдение дополняют ранее полученные данные, согласно которым активированные моноциты способствуют ретракции сгустка посредством экспрессии тканевого фактора и локальной генерации тромбина – самого сильного физиологического агониста тромбоцитов, усиливающего их сократимость [21]. Представляется вероятным, что совместный прокоагулянтный эффект активированных нейтрофилов и моноцитов может быть существенным фактором, усиливающим ретракцию воспалительных тромбов.

В качестве альтернативного механизма усиления ретракции сгустка активированными нейтрофилами мы обнаружили, что НВЛ изменяют механические свойства сгустков, снижая их жесткость и делая более подверженными деформации, что было установлено с помощью реологических измерений на тромбоэластограмме (рисунки 4Г, 5Б). Соответственно, ферментативное расщепление НВЛ ДНКазой I восстанавливало исходную эластичность сгустка. Этот эффект был более выражен в сгустках из цельной крови по сравнению со сгустками из PRP, которые характеризуются значительно большей упругостью за счет высокого содержания фибрина (рисунок 5В, Г). В целом эти данные указывают на то, что НВЛ размягчают сгустки крови, снижая устойчивость фибринового каркаса к сократительным силам, генерируемым тромбоцитами, и тем самым способствуя компрессии и компактизации сгустка. Аналогичный вывод был получен другими авторами на основе влияния ДНК и гистонов на механические свойства фибриновых сгустков, образованных стафилокоагулазой [22]. Следует отметить, что наблюдаемое нами и другими авторами размягчение плазменных сгустков в присутствии НВЛ внешне противоречит результатам, полученным Longstaff и соавт. [23], которые показали, что фибриновые сгустки, сформированные в присутствии смеси гистонов и ДНК, были более устойчивы к силам сдвига. Однако при внимательном анализе данной работы оказалось, что при добавлении по отдельности ДНК и гистоны оказывали противоположные эффекты на жесткость фибрина: в присутствии одной ДНК фибрин был более чувствителен к механической деформации. Это противоречие указывает на сложные взаимоотношения между отдельными компонентами НВЛ и механическими свойствами фибрина, которые зависят от концентраций добавляемых веществ и их соотношений, величины сдвигового напряжения и, возможно, других условий.

Усиленная ретракция сгустков крови под влиянием активированных нейтрофилов и НВЛ может иметь важные патофизиологические последствия, затрагивающие ключевые патогенные свойства тромбов, такие как обструктивность, чувствительность к фибринолизу и эмбологенность. По совокупности имеющихся данных сжатие сгустков крови, усиленное НВЛ, может снижать риск эмболизации и способствовать растворению тромба за счет эндогенного фибринолиза [8, 17], несмотря на то, что воспаление создает общий гиперкоагуляционный фон, способствующий тромбообразованию. Кроме того, интенсивность воспалительного процесса в тромбе имеет большое клиническое значение для эффективности лечения иммунотромбоза. В частности, наши результаты позволяют предположить, что усиленная ретракция воспалительных обтурирующих тромбов сопровождается снижением порозности и меньшей проницаемостью, что снижает чувствительность к лечебному экзогенному тромболизису и механической тромбэктомии [23–27].

Учитывая важную патогенетическую роль активированных нейтрофилов и НВЛ в развитии тромбов, оценка уровня растворимых биомаркеров НВЛ в крови [28] может улучшить диагностику, а также помочь в прогнозировании рисков при воспалительном тромбозе. Кроме того, адъювантная терапия, направленная на расщепление НВЛ или ингибирование их образования [29, 30], потенциально могла бы улучшить исходы иммунотромбоза, повысив эффективность лечения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе исследованы механизмы влияния воспалительных клеток, в частности активированных нейтрофилов, продуцирующих НВЛ, на ретракцию сгустков крови. Установлены 2 различных механизма, посредством которых НВЛ, встроенные в фибриновую сеть, усиливают ретракцию сгустка крови: увеличение локальной продукции эндогенного тромбина и влияние на механические свойства фибриновой сети внутри воспалительных сгустков. Полученные результаты позволяют предположить, что современные представления о воспалительном тромбозе, осложняющем течение многих инфекционных и аутоиммунных заболеваний, могут нуждаться в пересмотре и разработке новых подходов к лечению с учетом предрасположенности воспалительных тромбов к усиленной ретракции.

ЭТИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА

Все процедуры с участием людей были одобрены и утверждены решением локального этического комитета (протокол №53 от 26.02.2025) Казанского федерального университета.

ETHICS REVIEW

All the procedures involving human participants were approved by the Ethics Committee (Protocol No. 53 dated 26.02.2025) of Kazan Federal University.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда и Академии наук Республики Татарстан по проекту №25-25-20017 (https://rscf.ru/project/25-25-20017/).

FUNDING

The study was supported by a grant from the Russian Science Foundation and the Academy of Sciences of the Republic of Tatarstan under project No.25-25-20017 (https://rscf.ru/project/25-25-20017/).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

CONFLICT OF INTEREST

The authors declare no conflict of interest.

ВКЛАД АВТОРОВ

Р.Р. Хисматуллин: анализ научного материала и полученных данных, написание текста рукописи;

Ш.М. Саляхутдинова, А.И. Хабирова: проведение основных экспериментов;

А.Н. Хузиахмедов: научная редакция статьи;

Р.И. Литвинов: разработка дизайна статьи и редактирование рукописи.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

R.R. Khismatullin: analysis of research material and the obtained data, manuscript writing;

S.M. Saliakhutdinova, A.I. Khabirova: conducting the main experiments;

A.N. Khuziakhmedov: scientific revision of the article;

R.I. Litvinov: article design and manuscript editing.

About the authors

Rafael R. Khismatullin

Kazan Federal University

Author for correspondence.
Email: rafael.khismatullin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8597-811X

Cand. Med. Sci., a pathologist, associate professor at the Department of Morphology and General Pathology of the Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan

Sh. M. Saliakhutdinova

Kazan Federal University

Email: rafael.khismatullin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7647-2966
Russian Federation, Kazan

A. I. Khabirova

Kazan Federal University

Email: rafael.khismatullin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7243-8832
SPIN-code: 8388-2197
Russian Federation, Kazan

A. N. Khuziakhmedov

Kazan Federal University; The M.N. Sadykov City Clinical Hospital No.7

Email: rafael.khismatullin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7606-1323
Russian Federation, Kazan; Kazan

R. I. Litvinov

The University of Pennsylvani

Email: rafael.khismatullin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0643-1496

School of Medicine

United States, Philadelphia, Pennsylvania

References

Supplementary files