Essential thrombocythemia in childhood: features of platelet structure and function

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. Essential thrombocythemia (ET) is an orphan myeloproliferative disease with excessive platelet production associated with an increased risk of thrombosis and bleeding. Currently, there is a limited number of studies on the state of platelet hemostasis in children with ET.

Aim of this single-center prospective study was to characterize the morphological and functional properties of platelets in pediatric patients with ET.

Materials and methods. The study included 30 patients (10 boys and 20 girls) aged 3–17 years with an established diagnosis of ET. The control group consisted of 45 healthy volunteers (22 boys and 23 girls) aged 4–18 years. Flow cytometry with strong and weak activation, aggregometry, and immunofluorescence microscopy of blood smears were used to analyze platelet function.

Results. It was shown that platelets of patients with ET are characterized by a reduced size, while the number of platelet alpha and dense granules did not differ from the control group. Platelets of patients with ET showed moderate hyporeactivity in response to strong stimulation (by activation of glycoprotein IIbIIIa and secretion of dense granules). Platelet aggregation with collagen and adenosine diphosphate was also reduced in patients with ET, but these data did not correlate with the degree of platelet activation in flow cytometry.

Conclusion. Thus, characteristic morphological and functional changes in platelets were revealed in children with ET compared with the control group.

Full Text

Эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) у детей – орфанное хроническое Ph-негативное миелопролиферативное заболевание с оценочной частотой заболеваемости 0,6 случая на 100 тыс. детского населения, которое классически описано у пациентов в возрасте старше 60 лет [1]. Для данного заболевания, так же, как и для истинной полицитемии, характерно наличие тромбогеморрагических осложнений, однако их частота у пациентов младше 18 лет достоверно неизвестна [2]. Более того, по данным систематического обзора, частота тромботических осложнений не менялась после постановки диагноза, в то время как частота геморрагических осложнений возрастала [3]. Основная причина развития последних – приобретенный синдром Виллебранда вследствие увеличения числа циркулирующих тромбоцитов (достоверно проявляется при количестве тромбоцитов выше 1 500 × 109/л) [4, 5]. Патогенез развития тромботических осложнений намного более сложный. По данным, имеющимся в международной литературе, сообщений о взаимосвязи между количеством тромбоцитов и риском тромботических событий нет [2, 6, 7], а основными факторами риска считаются возраст старше 60 лет, тромботические события в анамнезе, наличие дополнительных факторов риска, а также наличие мутации JAK2V617F [8]. В то же время в реальной практике именно количество циркулирующих тромбоцитов, по-видимому, служит основанием для назначения антитромбоцитарной терапии – по данным французского исследования, до 50% пациентов на момент постановки диагноза уже получают антиагреганты, в основном ацетилсалициловую кислоту [2]. Целесообразность данных назначений остается предметом дискуссии.

На сегодняшний день существуют разрозненные данные о состоянии тромбоцитарного звена гемостаза у пациентов с ЭТ (в основном взрослых), при этом в большинстве опубликованных исследований в качестве основного метода, характеризующего функциональный статус тромбоцитов, используется оптическая агрегометрия [5, 9, 10], чья интерпретация и информативность могут быть сомнительными при использовании при больших отклонениях количества тромбоцитов от нормальных значений в соответствии с международными рекомендациями [11]. Данных же по другим методам оценки функции тромбоцитов (проточная цитофлуориметрия, иммунофлуоресцентная микроскопия) еще меньше [12–15], а полученные результаты свидетельствуют о некотором ингибировании функции тромбоцитов у пациентов с ЭТ.

Целью данного исследования стала оценка функционального статуса тромбоцитов у детей с ЭТ с помощью методов проточной цитофлуориметрии, оптической агрегации и иммунофлуоресцентного окрашивания мазков крови.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты и здоровые добровольцы

В одноцентровое проспективное исследование были включены 30 пациентов – 10 (33%) мальчиков и 20 (67%) девочек в возрасте от 3 до 17 лет (медиана – 11 лет) с установленным диагнозом ЭТ в соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения 2022 г. для взрослых пациентов. Всем пациентам в когорте была проведена трепанобиопсия, подтвердившая диагноз, за исключением самой младшей пациентки (3 года), которой было выполнено только исследование миелограммы, выявившее раздражение мегакариоцитарного ростка, количество тромбоцитов у данной пациентки составляло 2600 × 109/л. У 9 (30%) пациентов была мутация в гене JAK2, у 4 (13,3%) – мутация в гене CALR, у 1 – мутация в гене MPL, у остальных 16 (53,3%) пациентов не было драйверной мутации. Медианное значение количества тромбоцитов у пациентов составляло 1280 × 109/л (диапазон – 789–2630 × 109/л). Уровень гематокрита у пациентов был в пределах нормальных значений (31,3–46,3%, медиана – 37,2%). Пациенты на момент включения в исследование не получали специфической терапии. В качестве контрольной группы использовали образцы крови 45 здоровых добровольцев (22 мальчика и 23 девочки) в возрасте от 4 до 18 лет (медиана – 12 лет).

Лабораторные исследования тромбоцитов

Кровь у пациентов забирали в пробирку Monovette 3 мл с 106 мM цитрата натрия (рН 5,5) в соотношении кровь:цитрат, равном 9:1. Иммунофенотипирование тромбоцитов проводили в разбавленной цельной крови на проточном цитометре Novocyte 3000 (ACEA Biosciences Inc., США) в состоянии покоя и при двух типах стимуляции (сильная и слабая). Для сильной стимуляции тромбоцитов использовали смесь пептидов-активаторов PAR-рецепторов тромбина SFLLRN и AYPGKF – 200 мкM каждого, активатор P2Y-рецепторов – аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 10 мкM, также в смесь добавляли 2,5 мМ хлорида кальция (активация, используемая в тесте скринингового иммунофенотипирования тромбоцитов (СИФТ)). Для слабой стимуляции тромбоцитов 5 мкМ АДФ в присутствии 2,5 мМ хлорида кальция использовали протокол, описанный в работе E.A. Ponomarenko и соавт. [16]. Окрашивание тромбоцитов проводили с использованием флуоресцентно меченых антител (BD Biosciences, США) к Р-селектину (CD62P), активированной форме гликопротеина IIbIIIa (PAC1), а также маркера плотных гранул мепакрина (Sigma-Aldrich, США). Также оценивали параметры светорассеяния, характеризующие размер тромбоцитов (FSC-H) и гранулярность (SSC-H).

Агрегацию тромбоцитов оценивали на анализаторе агрегации Биола АЛАТ-2 (Россия) с использованием реагентов Агренам (Россия).

Для анализа тромбоцитов методом иммунофлуоресцентного окрашивания мазков крови были приготовлены мазки периферической крови пациентов с ЭТ (n = 10) и здоровых добровольцев (n = 10), как описано ранее [17, 18]. Использовали следующие комбинации первичных антител: CD63 (BD Biosciences, H5C6, 1:2500)/тяжелая цепь немышечного миозина (NMIIA) (Sigma Aldrich, 1:10 000), P-селектин (CD62p) (BD Biosciences, AK-4, 1:800)/NMIIA, фактор фон Виллебранда (Dako, 1:2000)/CD42 (Beckman Coulter, P2, 1:2000). В качестве вторичных антител использовали козьи антимышиные и козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с флуорохромами Alexa Fluor 488 (AF488) и Alexa Fluor 647 (AF647) соответственно (Имтек, разведение 1:400). Визуализацию проводили на флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse Ni-E, оснащенном масляным иммерсионным объективом ×60 и цветной камерой Nikon DS-Ri2.

Средний диаметр тромбоцитов оценивали методом флуоресцентной микроскопии мазков крови после проведения иммунофлуоресцентного окрашивания антителами к NMIIA. Для регистрации максимального диаметра применяли программный анализ изображений (ImageJ, версия 1.48, США), анализировали не менее 100 индивидуальных тромбоцитов для каждого пациента или здорового добровольца. Из анализа исключали тромбоциты, находящиеся в составе агрегатов. Затем рассчитывали среднее значение диаметра тромбоцитов для каждого пациента или добровольца.

Статистический анализ

Данные анализировали с использованием программного обеспечения Origin Pro 8.0 (США). Для сравнения данных пациентов и контрольной группы использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Для изучения связи между параметрами применяли коэффициент корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Размер неактивированных тромбоцитов (по FSC-H) был достоверно снижен у пациентов с ЭТ по сравнению с контрольной группой (рисунок 1А), медианы отличались в 1,3 раза. При этом параметр SSC-H, характеризующий гранулярность тромбоцитов, достоверно не отличался между группами (рисунок 1Б). Средний объем тромбоцитов (MPV) по общему анализу крови также был ниже нормы у 9 (30%) из 30 пациентов, медиана ± стандартное отклонение – 9,2 ± 0,6 фл при норме 11 ± 2 фл (рисунок 1В). Для параметра MPV была обнаружена умеренная достоверная обратная взаимосвязь с количеством тромбоцитов (рисунок 1Г), в то время как для параметра FSC-H достоверной зависимости от количества тромбоцитов не наблюдалось (рисунок 1Д). Средний диаметр тромбоцитов, измеренный по флуоресцентным изображениям в мазке крови, также был достоверно ниже для пациентов с ЭТ (2,17 ± 0,58 мкм) по сравнению с контролем (2,45 ± 0,59 мкм) (рисунок 1Е).

 

Рисунок 1. Размер тромбоцитов у пациентов с ЭТ

А, Б – параметры светорассеяния FSC-H (А) и SSC-H (Б), полученные методом проточной цитометрии; В – MPV по общему анализу крови; Г, Д – зависимость параметров MPV (Г) и FSC-H (Д) от количества тромбоцитов у пациентов с ЭТ; Е – средний диаметр тромбоцитов, полученный методом иммунофлуоресцентного окрашивания мазков крови пациентов с ЭТ (n = 10) и контрольной группы (n = 10)

Figure 1. Platelet size in the patients with essential thrombocythemia (ET)

А, Б – light scatter parameters FSC-H (А) and SSC-H (Б) obtained by flow cytometry; В – mean platelet volume (MPV) in a complete blood count; Г, Д – relationship between MPV (Г) and FSC-H (Д) parameters and platelet count in the patients with ET; Е – mean platelet diameter determined by immunofluorescence staining of blood smears from the patients with ET (n = 10) and the control group (n = 10)

 

В мазках крови у пациентов с ЭТ наблюдали выраженные морфологические аномалии, указывающие на спонтанную активацию тромбоцитов. В образцах здоровых добровольцев тромбоциты находятся в покоящемся состоянии и демонстрируют характерную дискоидную или овальную форму, а в образцах пациентов с ЭТ форма тромбоцитов была резко нерегулярной с появлением вытянутых и грушевидных форм, а также многочисленных псевдоподий (рисунок 2). Иммунофлуоресцентный анализ выявил сопутствующие структурные нарушения цитоскелета. В отличие от организованного перимембранного распределения у здоровых добровольцев локализация NMIIA у пациентов с ЭТ приобретала аномальный, диффузный и неоднородный характер.

Примечательно, что несмотря на признаки активации по форме тромбоцитов и цитоскелету не было обнаружено существенных различий в состоянии внутриклеточных гранул между пациентами и группой контроля (рисунок 2). Распределение и интенсивность сигналов от маркеров альфа-гранул (P-селектин/CD62P и фактор фон Виллебранда) и маркера плотных гранул (CD63) соответствовали нормальному, «наполненному» состоянию, характерному для покоящихся тромбоцитов. Значительной популяции дегранулированных тромбоцитов выявлено не было.

 

Рисунок 2. Репрезентативные микрофотографии тромбоцитов для пациентов с ЭТ и здоровых добровольцев (контроль), полученные с помощью флуоресцентной микроскопии

Для окрашивания использованы первичные антитела, специфичные к содержимому альфа-гранул (фактор фон Виллебранда (VWF) и Р-селектин CD62P) и плотных гранул (CD63), а также немышечному миозину IIА (NMIIA). Масштабная линейка соответствует 3 мкм

Figure 2. Representative micrographs of platelets from the patients with ET and healthy volunteers (control) obtained by fluorescence microscopy

Primary antibodies specific for the contents of alpha granules (von Willebrand factor (VWF) and P-selectin CD62P) and dense granules (CD63), as well as for non-muscle myosin IIA (NMIIA) were used for staining. The scale bar corresponds to 3 μm

 

В проточной цитометрии также наблюдали признаки спонтанной активации тромбоцитов по маркерам CD62P и PAC1 (рисунок 3А–Г). При сильной стимуляции смесью агонистов (активация СИФТ), а также при слабой активации АДФ не было достоверных отличий по экспрессии Р-селектина у пациентов с ЭТ по сравнению с контролем (рисунок 3А, В). При этом количество активированной формы гликопротеина IIbIIIa (по РАС1) было достоверно снижено у пациентов с ЭТ при сильной стимуляции (рисунок 3Б). При слабой активации АДФ наблюдалась обратная тенденция к увеличению экспрессии CD62P и РАС1 у пациентов с ЭТ, однако отличия не были достоверными (рисунок 3В, Г). Пациенты с ЭТ не отличались от контрольной группы по количеству плотных гранул (рисунок 3Д), однако при сильной стимуляции у пациентов с ЭТ наблюдали сниженную их секрецию (рисунок 3Д, Е).

 

Рисунок 3. Параметры активации тромбоцитов пациентов с ЭТ (n = 30), определяемые методом проточной цитометрии: экспрессия Р-селектина альфа-гранул (А, В), активированной формы гликопротеина IIbIIIa (Б, Г), а также плотные гранулы и их секреция по флуоресценции мепакрина (Д, Е)

Оценивали уровень спонтанной (покой) и индуцированной активации при сильной стимуляции смесью агонистов, используемой в тесте СИФТ (А, Б, Д, Е), а также при слабой активации АДФ (В, Г). Для активации СИФТ размер контрольной группы составлял 45, для активации АДФ – 11

Figure 3. Platelet activation parameters in the patients with ET (n = 30) determined by flow cytometry: the expression of alpha granule P-selectin (А, В), activated glycoprotein IIbIIIa (Б, Г), as well as dense granules and their secretion assessed by mepacrine fluorescence (Д, Е)

Levels of spontaneous (in a resting state) and induced platelet activation upon strong stimulation with an agonist mixture used in the screening platelet immunophenotyping (SPIP) assay (А, Б, Д, Е), as well as upon weak activation with adenosine diphosphate (ADP) (В, Г) were assessed.In case of SPIP activation, the control group size was 45, and in case of ADP activation – 11

 

Агрегация с АДФ и коллагеном была снижена у 30% пациентов с ЭТ (рисунок 4А, Б), при этом не было взаимосвязи между параметрами агрегации с этими двумя активаторами. То есть снижение агрегации с одним агонистом не означало, что она будет снижена и с другим. На корреляционных графиках (рисунок 4В–К) продемонстрировано отсутствие зависимости между параметрами агрегации тромбоцитов пациентов с ЭТ и активацией тромбоцитов (по РАС1 и CD62P), измеренной методом проточной цитометрии. Также не было обнаружено достоверной корреляции между активацией тромбоцитов (по CD62P и PAC1) и их количеством у пациентов по общему анализу крови (данные не представлены).

 

Рисунок 4. А, Б – исследование агрегации тромбоцитов у пациентов с ЭТ (n = 30). Серым цветом помечены точки, для которых снижена агрегация с другим агонистом – коллагеном (А) или АДФ (Б); В–К – связь параметров агрегации тромбоцитов и их индуцированной активации методом проточной цитометрии при сильной стимуляции смесью агонистов, используемой в тесте СИФТ (В–Е), а также при слабой активации АДФ (Ж–К)

Figure 4. А, Б – platelet aggregation analysis in the patients with ET (n = 30). Grey color indicates the dots for which aggregation with another agonist, collagen (А) or ADP (Б), is reduced; В–К – relationship between the parameters of platelet aggregation and their induced activation by flow cytometry upon strong stimulation with an agonist mixture used in the screening platelet immunophenotyping (SPIP) assay (В–Е), as well as upon weak activation with ADP (Ж–К)

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данном исследовании с применением современных методов проточной цитометрии и иммунофлуоресцентного окрашивания тромбоцитов в мазке крови было показано, что тромбоциты пациентов с ЭТ:

  1. уменьшены в размере по сравнению с тромбоцитами здоровых добровольцев;
  2. имеют признаки предактивации по изменению формы, диффузному характеру распределения NMIIA и экспрессии активационных маркеров (CD62P и PAC1) в отсутствие стимуляции;
  3. характеризуются умеренной гипореактивностью в ответ на сильную стимуляцию смесью агонистов рецепторов тромбина и АДФ (по экспрессии PAC1 и секреции плотных гранул), но не на слабую стимуляцию АДФ. При этом степень активации тромбоцитов в проточной цитометрии не коррелировала с результатами оптической агрегометрии.

Уменьшенный размер тромбоцитов у пациентов с ЭТ отмечали ранее как в наших работах [14, 15] для детей, так и в работах зарубежных авторов [19] для взрослых пациентов. При этом в других исследованиях MPV у взрослых пациентов с ЭТ был в пределах нормальных значений [13, 20, 21], что может быть связано как с возрастными особенностями, так и с более низким количеством тромбоцитов у пациентов по сравнению с нашим исследованием. В настоящем исследовании мы показали, что размер тромбоцитов у пациентов с ЭТ по светорассеянию в проточной цитометрии хорошо согласуется как с данными, полученными методом флуоресцентной микроскопии в мазке, так и со средним размером тромбоцитов по общему анализу крови. Размер тромбоцитов может быть как связан с количеством тромбоцитов у пациента, так и объясняться характерными структурными нарушениями цитоскелета тромбоцитов у пациентов с ЭТ.

Несмотря на уменьшенный размер тромбоцитов, количество плотных и альфа-гранул (по данным проточной цитометрии и иммунофлуоресцентной микроскопии), а также параметр SSC-Н, отражающий гранулярность тромбоцитов, не отличались для пациентов с ЭТ от контрольной группы. Этот результат согласуется с более ранним исследованием, проведенным нами на другой группе пациентов с ЭТ [15], и указывает на повышение гранулярности относительно размера тромбоцитов.

Предактивация тромбоцитов у пациентов с ЭТ, наблюдаемая нами как методом иммунофлуоресцентной микроскопии, так и проточной цитометрии, согласуется с данными проточной цитометрии для взрослых пациентов с ЭТ [22, 23]. Важно понимать, что предактивация тромбоцитов может происходить как in vivo в сосудистом русле, однако, как правило, такие тромбоциты быстро элиминируются из кровотока, так и после забора крови у пациента в процессе анализа, отражая повышенную склонность тромбоцитов к активации по сравнению с контролем.

Агрегация тромбоцитов при ЭТ в большинстве своем исследована разными методиками с применением различных агонистов у взрослых пациентов [24, 25]. Результаты этих исследований противоречивы: некоторые из них показали сниженный ответ тромбоцитов на агонисты [10, 25], а в других исследованиях у пациентов с ЭТ были обнаружены более высокие значения агрегации по сравнению со здоровыми людьми [13, 26]. В работе Pedersen и соавт. [13] показано, что у взрослых пациентов с ЭТ есть корреляция между количеством тромбоцитов и увеличением значений агрегации с АДФ, TRAP и арахидоновой кислотой. В исследовании Kanya и соавт. [10], напротив, показано снижение агрегации с АДФ и коллагеном в 20% и 38% случаев соответственно. В статье Zeidman и соавт. [26] показано, что у 22% пациентов наблюдалась спонтанная агрегация тромбоцитов без добавления агониста, при этом 57% пациентов имели снижение агрегации с АДФ в этой же группе обследуемых. В нашем исследовании также наблюдается снижение агрегации у части пациентов с АДФ и коллагеном, у 1 пациента агрегация с АДФ была слегка повышена. Таким образом, сейчас нельзя однозначно говорить об общей тенденции изменений в параметрах агрегации у пациентов с ЭТ в детском возрасте, что в целом соответствует разрозненным данным у взрослых пациентов.

Гипореактивность тромбоцитов при активации в проточной цитометрии также отмечали ранее у пациентов с ЭТ [14, 22]. Отсутствие взаимосвязи между данными проточной цитометрии и агрегации может объясняться техническими различиями методов исследования. В проточной цитометрии оценивается функциональный ответ индивидуальных тромбоцитов и результат исследования не зависит от количества тромбоцитов у пациента, в то время как для оптической агрегометрии известно об ограничениях, связанных с количеством тромбоцитов, превышающим нормальные значения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, у детей с ЭТ были выявлены характерные морфологические и функциональные изменения тромбоцитов по сравнению с контрольной группой.

ВКЛАД АВТОРОВ

А.А. Игнатова: анализ данных, написание, пересмотр и редактирование текста;

Е.В. Юшкова, Е.А. Серёгина: анализ данных, написание и редактирование текста;

И.А. Чабин: написание и редактирование текста;

П.В. Краличкин: рекрутирование пациентов;

Е.А. Пономаренко: анализ данных;

Н.А. Подоплелова: пересмотр и редактирование текста;

А.В. Пшонкин: дизайн исследования, рекрутирование пациентов;

Н.С. Сметанина, М.А. Пантелеев: дизайн исследования, пересмотр и редактирование текста, руководство исследованием.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

A.A. Ignatova: data analysis, manuscript writing, revision and editing;

E.V. Yushkova, E.A. Seregina: data analysis, manuscript writing and editing;

I.A. Chabin: manuscript writing and editing;

P.V. Kralichkin: patient recruitment;

E.A. Ponomarenko: data analysis;

N.A. Podoplelova: manuscript revision and editing;

A.V. Pshonkin: study design, patient recruitment;

N.S. Smetanina, M.A. Panteleev: study design, manuscript revision and editing, supervision.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Авторы выражают благодарность сотрудникам лаборатории клеточного гемостаза и тромбоза НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева М.Д. Сысоеву, Л.С. Погодиной, Г.С. Свидельской за помощь в проведении измерений методом проточной цитометрии, а также фонду «Наука – детям» за поддержку данного исследования.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors would like to thank the staff of the Laboratory of Cellular Hemostasis and Thrombosis of the Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology – M.D. Sysoev, L.S. Pogodina, and G.S. Svidelskaya – for their assistance with flow cytometry measurements, as well as the Science for Children Foundation for the support of the study.

ЭТИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА

Исследование одобрено независимым этическим комитетом и утверждено решением ученого совета ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России (протокол 8/2016 от 28.10.2016).

ETHICS REVIEW

The study was approved by the Independent Ethics Committee and the Scientific Council of the Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology (protocol No. 8/2016 dated 28.10.2016).

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект №24-15-00387).

FUNDING

The study was supported by a grant from the Russian Science Foundation (project No. 24-15-00387).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

CONFLICT OF INTEREST

The authors confirm that there is no conflict of interest to declare.

×

About the authors

A. A. Ignatova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: anastasiya.ignatova@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0002-5217-3937

Researcher at the Laboratory of Cellular Hemostasis and Thrombosis

Russian Federation, Moscow

E. V. Yushkova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Email: anastasiya.ignatova@dgoi.ru
ORCID iD: 0009-0007-3456-9616
Russian Federation, Moscow; Moscow

I. A. Chabin

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: anastasiya.ignatova@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0003-0625-1743
Russian Federation, Moscow

P. V. Kralichkin

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: anastasiya.ignatova@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0001-8088-1749
Russian Federation, Moscow

E. A. Ponomarenko

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: anastasiya.ignatova@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0002-8697-7570
Russian Federation, Moscow

E. A. Seregina

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Email: anastasiya.ignatova@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0002-7534-3863
Russian Federation, Moscow; Moscow

N. A. Podoplelova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Email: anastasiya.ignatova@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0001-8013-1112
Russian Federation, Moscow; Moscow

A. V. Pshonkin

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: anastasiya.ignatova@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0002-2057-2036
Russian Federation, Moscow

N. S. Smetanina

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: anastasiya.ignatova@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0002-8805-1499
Russian Federation, Moscow

M. A. Panteleev

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Email: anastasiya.ignatova@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0002-8128-7757
Russian Federation, Moscow; Moscow

References

  1. Vannucchi A.M., Barbui T., Cervantes F., Harrison C., Kiladjian J.J., Kröger N. et al. Philadelphia chromosome-negative chronic myeloproliferative neoplasms: Esmo clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2015;26:v85–99.
  2. Picard A., Bayart S., Deparis M., De Maricourt C.D., Haro S., Jourdain A. et al. Polycythemia vera and essential thrombocythemia in children, still a challenge for pediatricians. Eur J Pediatr 2025;184.
  3. Ianotto J.-C., Curto-Garcia N., Lauermanova M., Radia D., Kiladjian J.-J., Harrison C.N. Characteristics and outcomes of patients with essential thrombocythemia or polycythemia vera diagnosed before 20 years of age: A systematic review. Haematologica 2019;104:1580–8.
  4. Budde U., van Genderen P. Acquired von Willebrand disease in patients with high platelet counts. Semin Thromb Hemost 2008;23:425–31.
  5. Серёгина Е.А., Краличкин П.В., Богданов А.В., Флоринский Д.Б., Пшонкин А.В., Сысоев М.Д. и др. Состояние системы гемостаза у пациентов с миелопролиферативным новообразованием: первичные результаты. Российский журнал детской гематологии и онкологии 2025;12(3):47–55. [Seregina E.A., Kralichkin P.V., Bogdanov A.V., Florinsky D.B., Pshonkin A.V., Sysoev M.D. et al. The state of the hemostasis system in patients with myeloproliferative neoplasm: Primary results. Russian Journal of Pediatric Hematology and Oncology. 2025;12:47–55. (In Russ.)].
  6. Barbui T., Barosi G., Birgegard G., Cervantes F., Finazzi G., Griesshammer M. et al. Philadelphia-negative classical myeloproliferative neoplasms: Critical concepts and management recommendations from european leukemianet. J Clin Oncol 2011;29:761–70.
  7. Barbui T., Tefferi A., Vannucchi A.M., Passamonti F., Silver R.T., Hoffman R. et al. Philadelphia chromosome-negative classical myeloproliferative neoplasms: Revised management recommendations from european leukemianet. Leukemia 2018;32:1057–69.
  8. Barbui T., Finazzi G., Carobbio A., Thiele J., Passamonti F., Rumi E. et al. Development and validation of an International Prognostic Score of thrombosis in World Health Organization – essential thrombocythemia (IPSET-thrombosis). Blood 2012;120:5128–33.
  9. Jaime-Perez J.C., Gomez-Almaguer D. Platelet refractoriness to classical agonists in a child with essential thrombocythemia. Platelets 2009;16:61–2.
  10. Kanya P., Rattarittamrong E., Wongtakan O., Rattanathammethee T., Chai-Adisaksopha C., Tantiworawit A. et al. Platelet function tests and inflammatory markers for the differentiation of primary thrombocytosis and secondary thrombocytosis. Asian Pac J Cancer Prev 2019;20:2079–85.
  11. Cattaneo M., Cerletti C., Harrison P., Hayward C.P.M., Kenny D., Nugent D. et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of ssc/isth. J Thromb Haemost 2013;11:1183–9.
  12. Dong H., Chen J., Zhang J., Xue F., Li H., Zhang D. et al. Reduced platelet activation in triple-negative essential thrombocythemia compared with jak2v617f-mutated essential thrombocythemia. Clin Cancer Res 2024;30:5473–82.
  13. Pedersen O.H., Larsen M.L., Grove E.L., van Kooten Niekerk P.B., Bønløkke S., Nissen P.H. et al. Platelet characteristics in patients with essential thrombocytosis. Cytometry B Clin Cytom 2018;94:918–27.
  14. Polokhov D.M., Ershov N.M., Ignatova A.A., Ponomarenko E.A., Gaskova M.V., Zharkov P.A. et al. Platelet function and blood coagulation system status in childhood essential thrombocythemia. Platelets 2019;31:1001–11.
  15. Полохов Д.М., Игнатова А.А., Краличкин П.В., Пшонкин А.В., Богданов А.В., Полетаев А.В. и др. Морфофункциональные нарушения тромбоцитов у детей при эссенциальной тромбоцитемии и истинной полицитемии. Гематология и трансфузиология 2025;70(3):336–47. doi: 10.35754/0234-5730-2025-70-3-336-347 [Polokhov D.M., Ignatova A.A., Kralichkin P.V., Pshonkin A.V., Bogdanov A.V., Poletaev A.V. et al. Morphofunctional disorders of platelets in children with essential thrombocythemia and polycythemia vera. Russian Journal of Hematology and Transfusiology 2025;70:336–47. (In Russ.)].
  16. Ponomarenko E.A., Ignatova A.A., Polokhov D.M., Filkova A.A., Suntsova E.V., Zharkov P.A. et al. Flow cytometry for comprehensive assessment of platelet functional activity in response to adp stimulation. Eur J Haematol 2024;112:554–65.
  17. Greinacher A., Pecci A., Kunishima S., Althaus K., Nurden P., Balduini C.L. et al. Diagnosis of inherited platelet disorders on a blood smear: A tool to facilitate worldwide diagnosis of platelet disorders. J Thromb Haemost 2017;15:1511–21.
  18. Юшкова Е.В., Подоплелова Н.А., Федорова Д.В., Хорева А.Л., Щербина А.Ю., Жарков П.А., Пантелеев М.А. Опыт использования иммунофлуоресцентного окрашивания мазков крови для диагностики наследственных тромбоцитопатий. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2023;22(3):43–7. doi: 10.24287/1726-1708-2023-22-3-43-47 [Yushkova E.V., Podoplelova N.A., Fedorova D.V., Khoreva A.L., Shcherbina A.Y., Zharkov P.A., Panteleev M.A. A single-center experience of using immunofluorescence staining of blood smears for the diagnosis of hereditary thrombocytopathies. Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology 2023;22:43–7. (In Russ.)].
  19. Lee E., Kim M., Jeon K., Lee J., Lee J.S., Kim H.S. et al. Mean platelet volume and platelet distribution width indicate that platelets remain small for most of their lifespans in patients with essential thrombocythemia. Clin Lab 2019;65.
  20. Pedersen O.B., Grove E.L., Pasalic L., Ommen H.B., Kristensen S.D., Hvas A.M. Cytoreductive treatment and association with platelet function and maturity in patients with essential thrombocythaemia. Br J Haematol 2022;198:693–702.
  21. Remenyi G., Szasz R., Debreceni I.B., Szarvas M., Batar P., Nagy B. Jr et al. Comparison of coated-platelet levels in patients with essential thrombocythemia with and without hydroxyurea treatment. Platelets 2013;24:486–92.
  22. Connor D.E., Ma D.D., Joseph J.E. Flow cytometry demonstrates differences in platelet reactivity and microparticle formation in subjects with thrombocytopenia or thrombocytosis due to primary haematological disorders. Thromb Res 2013;132:572–7.
  23. Karakantza M., Giannakoulas N.C., Zikos P., Sakellaropoulos G., Kouraklis A., Aktypi A. et al. Markers of endothelial and in vivo platelet activation in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera. Int J Hematol 2004;79:253–9.
  24. Kvernberg J., Grove E.L., Ommen H.B., Hvas A.M. Platelet function and turnover in essential thrombocythemia: A systematic review. Semin Thromb Hemost 2021;47:90–101.
  25. Lussana F., Femia E.A., Pugliano M., Podda G., Razzari C., Maugeri N. et al. Evaluation of platelet function in essential thrombocythemia under different analytical conditions. Platelets 2020;31:179–86.
  26. Zeidman A., Sokolover N., Fradin Z., Cohen A., Redlich O., Mittelman M. Platelet function and its clinical significance in the myelodysplastic syndromes. Hematol J 2004;5:234–8.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure 1. Platelet size in the patients with essential thrombocythemia (ET). А, Б – light scatter parameters FSC-H (А) and SSC-H (Б) obtained by flow cytometry; В – mean platelet volume (MPV) in a complete blood count; Г, Д – relationship between MPV (Г) and FSC-H (Д) parameters and platelet count in the patients with ET; Е – mean platelet diameter determined by immunofluorescence staining of blood smears from the patients with ET (n = 10) and the control group (n = 10)

Download (232KB)
Indexing metadata
3. Figure 2. Representative micrographs of platelets from the patients with ET and healthy volunteers (control) obtained by fluorescence microscopy. Primary antibodies specific for the contents of alpha granules (von Willebrand factor (VWF) and P-selectin CD62P) and dense granules (CD63), as well as for non-muscle myosin IIA (NMIIA) were used for staining. The scale bar corresponds to 3 μm

Download (120KB)
Indexing metadata
4. Figure 3. Platelet activation parameters in the patients with ET (n = 30) determined by flow cytometry: the expression of alpha granule P-selectin (А, В), activated glycoprotein IIbIIIa (Б, Г), as well as dense granules and their secretion assessed by mepacrine fluorescence (Д, Е). Levels of spontaneous (in a resting state) and induced platelet activation upon strong stimulation with an agonist mixture used in the screening platelet immunophenotyping (SPIP) assay (А, Б, Д, Е), as well as upon weak activation with adenosine diphosphate (ADP) (В, Г) were assessed.In case of SPIP activation, the control group size was 45, and in case of ADP activation – 11

Download (423KB)
Indexing metadata
5. Figure 4. А, Б – platelet aggregation analysis in the patients with ET (n = 30). Grey color indicates the dots for which aggregation with another agonist, collagen (А) or ADP (Б), is reduced; В–К – relationship between the parameters of platelet aggregation and their induced activation by flow cytometry upon strong stimulation with an agonist mixture used in the screening platelet immunophenotyping (SPIP) assay (В–Е), as well as upon weak activation with ADP (Ж–К)

Download (882KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2026 «D. Rogachev NMRCPHOI»

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.