Differential diagnosis of hereditary hemolytic anemias caused by glycolytic enzyme deficiencies

Full Text

Общей причиной наследственных гемолитических анемий (НГА) является сокращение времени жизни эритроцитов в кровотоке, что приводит к снижению концентрации гемоглобина и/или количества эритроцитов в крови и вызывает анемию [1]. НГА имеют различные причины, но часто очень схожие клинические проявления. Это осложняет дифференциальный диагноз причин анемии, который необходим для проведения правильной терапии. В первую очередь это касается вопроса о целесообразности проведения спленэктомии, так как ее эффективность при разных видах НГА различна [2–6], а также возможности других видов терапии, например трансплантации костного мозга, генной терапии или применения активатора пируваткиназы (ПК) митапивата [7–10]. Причинами анемии могут быть дефициты отдельных ферментов эритроцитов (ферментопатии), нарушения в структуре белков мембраны эритроцита (мембранопатии) или в структуре гемоглобина (гемоглобинопатии) [11–13].

Описанные распределения частоты дефицитов различных ферментов в эритроцитах в разных странах значительно различаются. По данным работы М.А. Луняковой и др. [14], наиболее частыми причинами НГА в России являются талассемии, наследственный сфероцитоз, а также дефициты гликолитического фермента ПК и головного фермента пентозофосфатного пути в эритроцитах глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД). Кроме того, встречаются, хотя и гораздо реже, дефициты других ферментов гликолиза, в первую очередь, глюкозофосфатизомеразы (ГФИ) и гексокиназы (ГК). Дефицит ПК составляет примерно 4,8% от общего числа НГА (или 74,3% от других определенных дефицитов ферментов гликолиза), а дефицит Г6ФД – 2,3% от общего числа НГА. Примерно 8,1% всех энзимопатий в нашем регистре остаются недиагностированными. Талассемию и различные гемоглобинопатии диагностируют, опираясь на клинический анализ крови и исследование мазков периферической крови с последующим подтверждением диагноза с помощью капиллярного электрофореза или высокоэффективной жидкостной хромотографии гемоглобина [15, 16]. Существуют также различные методы для диагностики нарушений в мембранах эритроцитов. Такие нарушения приводят, как правило, к снижению деформируемости эритроцитов и, следовательно, к снижению их способности проходить по узким капиллярам и синусам селезенки, в которой эти клетки усиленно секвестрируются, что ведет к анемии. Для диагностики возможных нарушений в мембранах эритроцитов существует несколько различных диагностических тестов, таких как ЭМА-тест (тест связывания эозин-5’-малеимида с поверхностью эритроцитов, которое уменьшается при НГА) [17, 18], измерение фильтруемости эритроцитов [19], определение осмотической резистентности эритроцитов [20]. Для диагностики мембранопатий и гемоглобинопатий обычно исследуют мазки периферической крови, а также эритроцитарные индексы (средний объем эритроцита, средняя концентрация гемоглобина в эритроците и их индекс сферичности) [18, 21]. В сложных случаях также проводят электрофорез фракций гемоглобина или мембранных белков эритроцитов.

В отличие от мембранопатий и гемоглобинопатий, для диагностики которых существует достаточно большое число методов, энзимопатии часто не вызывают существенных изменений морфологии эритроцитов или их осмотической резистентности [13, 22]. Что касается диагностики энзимопатий, то по общепринятым мировым стандартам существование такой энзимопатии должно быть доказано только прямым измерением активности конкретного фермента в циркулирующих эритроцитах, которая в случае его дефицита должна быть снижена, и результатами молекулярно-генетического анализа, который должен подтвердить наличие поломки гена, кодирующего этот фермент [13, 23, 24]. Однако поскольку дефициты этих ферментов встречаются очень редко, во всем мире измерение их активности проводят лишь в крупных диагностических центрах. К сожалению, в России к настоящему времени в клиническую практику внедрен только метод измерения активности Г6ФД, предложенный E. Beutler [25]. Настоящая работа посвящена разработке для последующего внедрения в клиническую практику биохимических методов измерения активности ферментов гликолиза, которые наиболее часто вызывают наследственную несфероцитарную гемолитическую анемию (ПК, ГФИ и ГК), что улучшит процесс дифференциальной диагностики НГА, вызванных различными ферментопатиями эритроцитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Доноры и пациенты

В работе была исследована кровь здоровых доноров, а также пациентов с НГА различной этиологии, обследованных в НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева в 2024–2025 гг.

Материалы

В работе были использованы следующие реактивы фирмы Sigma-Aldrich (США): забуференный фосфатом солевой раствор; буфер ХЕПЕС; буфер Трис-НСl; глюкоза; аденозинтрифосфат (АТФ); фруктозо-6-фосфат; L-лактатдегидрогеназа из мышц кролика, тип II, суспензия в растворе сульфата аммония (лактатдегидрогеназа (ЛДГ)); ПК из мышц кролика, тип II, суспензия в растворе сульфата аммония (ПК); Г6ФД из пекарских дрожжей (S. Cerevisiae), тип XV, лиофилизированный порошок; а также никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ) фирмы Roche Diagnostics (Германия); никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) восстановленный фирмы Carl Roth GmbH + Co (Германия); b-меркаптоэтанол (Ferak, Берлин, Германия); аденозиндифосфат (АДФ) (Santa Cruz Biotechnology, Гейдельберг, Германия); фосфоенолпируват (abcr GmbH, Карлсруэ, Германия); NaCl (AppliChem GmbH, Дармштадт, Германия); KCl (Kirsch Pharma GmbH, Зальцгиттер, Германия), MgCl₂ (Panreac Química SLU, Барселона, Испания); этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (ДИАЭМ, Москва, Россия) и набор для определения гемоглобина «Гемоглобин-Агат» (ООО Агат-Мед, Москва, Россия).

Забор крови у пациентов и доноров проводили в стерильные вакуумные пробирки S-Monovette фирмы Sarstedt (Нюмбрехт, Германия) объемом 4,9 мл с K₃ЭДТА в качестве антикоагулянта. Для удаления из крови лейкоцитов использовали колонку с микроцеллюлозой (Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Махараштра, Индия).

Приготовление гемолизата эритроцитов

Удаление лейкоцитов из крови проводили на колонке с микроцеллюлозой по модифицированному нами методу из книги E. Beutler [25]. Из очищенной от лейкоцитов суспензии эритроцитов готовили гемолизат в водном растворе 0,7 мМ b-меркаптоэтанола с 2,7 мМ ЭДТА (рН 7.4) путем замораживания и последующего оттаивания согласно методу E. Beutler [25].

Измерение концентрации гемоглобина

Концентрацию гемоглобина в гемолизате определяли цианметгемоглобиновым методом [25] с использованием набора «Агат-Мед» (Москва, Россия).

Измерение активности ферментов гликолиза

Активности всех исследованных ферментов (ПК, ГФИ и ГК) были измерены в гемолизатах эритроцитов спектрофотометрическими методами с помощью сопряженных биохимических реакций, приводящих к изменению оптической плотности реакционной пробы на длине волны 340 нм.

За основу всех методов были взяты методики, описанные в работе E. Beutler [25], которые были модифицированы и адаптированы для проведения измерений в малых объемах с помощью планшетного фотометрического ридера. Активность всех измеряемых ферментов представляли в Международных единицах на грамм гемоглобина (ME/г Hb).

В качестве референсного интервала нормальных значений для всех ферментов был использован 95% референсный интервал, включающий от 2,5 до 97,5 процентилей всех измеренных значений активности фермента у здоровых доноров.

Измерение активности пируваткиназы в гемолизатах эритроцитов

Схема сопряженных реакций для измерения активности ПК выглядит следующим образом:

$\mathrm{ПК}: \mathrm{фосфоенолпируват}+\mathrm{АДФ}\to \mathrm{пируват}+\mathrm{АТФ}$, (1)

$\mathrm{ЛДГ}: \mathrm{пируват}+\mathrm{НАДH}+{\mathrm{H}}^{+}\leftrightarrow \mathrm{лактат}+{\mathrm{НАД}}^{+}$, (2)

где НАД⁺ и НАДН – окисленная и восстановленная формы НАДН соответственно. От работы E. Beutler [25] предлагаемая методика отличается использованием буфера ХЕПЕС (рН 7.4) вместо Трис-HCl (рН 8.0).

Скорость снижения оптической плотности НАДH измеряли при 37°С на длине волны 340 нм, которую затем пересчитывали в активность фермента в ME/г Hb.

Измерение активности гексокиназы

Измерение ГК проводили, используя следующие сопряженные реакции:

$\mathrm{ГK}: \mathrm{глюкоза}+\mathrm{АТФ}\leftrightarrow \mathrm{глюкозо}-6-\mathrm{фосфат}+\mathrm{АДФ}$, (3)

$\mathrm{Г}6\mathrm{ФД}: \mathrm{глюкозо}-6-\mathrm{фосфат}+\mathrm{НАДФ}\leftrightarrow 6-\mathrm{фосфоглюконат}+\mathrm{НАДФН}+{\mathrm{Н}}^{+}$, (4)

где НАДФ и НАДФН – окисленная и восстановленная форма НАДФ соответственно. Измеряли скорость увеличения оптической плотности НАДФH при 37˚С на длине волны 340 нм, которую затем пересчитывали в активность фермента в МЕ/г Hb.

Измерение активности глюкозофосфатизомеразы

Измерение проводили, используя две сопряженные биохимические реакции:

ГФИ: глюкозо-6-фосфат ↔ фруктозо-6-фосфат (5),

Г6ФД: глюкозо-6-фосфат + НАДФ ↔ 6-фосфоглюконат + НАДФН + Н⁺ (6).

В условиях, при которых проводят определение, первая реакция идет справа налево. Скорость реакции и, соответственно, активность фермента определяли по скорости возрастания оптической плотности НАДФН на длине волны 340 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Измерение активности пируваткиназы

Сначала была проверена линейность и измерена чувствительность метода в диапазоне измеряемых активностей ПК. Для этого была проведена серия измерений в пробах с известной активностью ПК. Для каждой из проб была определена скорость снижения оптической плотности на 340 нм (рисунок А). Полученные результаты показали, что метод линеен во всей области исследованных активностей ПК в лунке планшета. При этом скорость снижения D₃₄₀ изменяется на 0,129 ± 0,007 ед. оптич. пл./мин при повышении активности ПК в лунке планшета на 0,1 МЕ/мл.

 

Рисунок. Активность ПК, ГК и ГФИ в эритроцитах доноров и пациентов с различными анемиями

Зеленые точки – активность фермента в эритроцитах доноров, красные – пациенты с подтвержденным генетически дефицитом данного фермента, розовые – пациенты с подтвержденным дефицитом данного фермента, но после недавней трансфузии, синие – пациенты с генетически подтвержденной другой НГА, серые – пациенты, у которых отсутствовали результаты генетического анализа; желтые – пациенты, у которых генетический анализ не выявил никаких мутаций.

А – измерение линейности метода определения активности ПК и его чувствительности в области измеряемых значений. Скорость снижения оптической плотности в пробах с известной активностью добавленной ПК была измерена на длине волны 340 нм; Б – активность ПК в эритроцитах доноров (n = 95) и пациентов с различными анемиями (n = 452), у 51 пациента дефицит ПК подтвержден генетически; В – активность ГК в эритроцитах доноров (n = 53) и пациентов с различными НГА (n = 113), 2 из которых имели генетически подтвержденный дефицит ГК (у одного измерения были сделаны после трансфузии донорских эритроцитов), а 53 – генетически подтвержденные другие НГА; Г – активность ГФИ в эритроцитах доноров (n = 30) и пациентов (n = 7). У 2 пациентов дефицит ГФИ был подтвержден генетически. Один из них был гомозиготен с мутацией с1028А>G (красная точка), а другой – компаунд-гетерозиготен (мутации с1028А>G и с214-8_ 214-3delinsG), но исследование у него было проведено через 1 мес после трансфузии донорских эритроцитов (розовая точка). Представлены также 2 пациента, гетерозиготных по мутациям ГФИ (голубые точки), которые являлись родителями компаунд-гетерозиготного пациента. У остальных 3 пациентов генетический анализ отсутствовал. Размер боксов соответствует области от 25-го до 75-го процентиля всех измеренных величин. Медианы показаны горизонтальными линиями, длина «усов» соответствует величинам от 2,5 до 97,5% всех измеренных значений

Figure. The activity of pyruvate kinase (PK), hexokinase (HK), and glucose phosphate isomerase (GPI) in red blood cells (RBCs) of the donors and the patients with various anemias

Green dots – enzyme activity in donor RBCs; red dots – patients with a genetically confirmed deficiency of the enzyme in question; pink dots – patients with a confirmed deficiency of the enzyme but after a recent transfusion; blue dots – patients with some other genetically confirmed hereditary hemolytic anemia (HHA); grey dots – patients without genetic test results; yellow dots – patients without any identified genetic mutations

A – the measurement of the linearity of the PK activity determination method and its sensitivity in the range of the measured values. Optical density reduction rate in samples with known activity of the added PK was measured at a wavelength of 340 nm; Б – PK activity in RBCs of the donors (n = 95) and the patients with various anemias (n = 452), with PK deficiency genetically confirmed in 51 of these patients; В – HK activity in RBCs of the donors (n = 53) and patients with various HHAs (n = 113), with HK deficiency genetically confirmed in 2 of them (one patient was tested after a donor RBC transfusion), and other HHAs genetically confirmed in 53 patients; Г – GPI activity in RBCs of the donors (n = 30) and the patients (n = 7). Two patients had a genetically confirmed GPI deficiency. One of them was homozygous for the c.1028A>G mutation (the red dot), and the other was compound heterozygous (the c.1028A>G and c.214-8_214-3delinsG mutations) but the assay in this patient was performed 1 month after donor RBC transfusion (the pink dot). The plot also shows 2 patients heterozygous for GPI mutations (the light blue dots) who were the parents of the compound-heterozygous patient. In the remaining 3 patients, genetic test results were unavailable. The size of the boxes corresponds to a range from the 25th to the 75th percentile of all the measured values. The medians are represented by horizontal lines; the whiskers extend from 2.5% to 97.5% of all the measured values

 

Дефицит ПК является самым частым среди ферментов гликолиза. Это позволило провести измерения на большом количестве проб не только доноров (n = 95), но и пациентов с гемолитическими анемиями разной этиологии (n = 452), у части которых дефицит ПК был подтвержден молекулярно-генетическим исследованием (n = 51). Полученные результаты представлены на рисунке Б.

Референсный диапазон значений активности ПК в норме (в эритроцитах доноров), полученный в нашей лаборатории, составил 8,41–16,42 МЕ/г Hb (медиана – 10,85 ME/г Hb; n = 95) (рисунок Б), или, если использовать среднее значение этой активности ± стандартное отклонение, то 11,31 ± 2,08 МЕ/г Hb (аналогичное значение в работе E. Beutler [25] составляет 15,0 ± 1,99 МЕ/г Hb). Однако из литературы известно, что получаемые значения активности сильно зависят как от использованных реактивов, так и от приборов, на которых проводят измерение, поэтому рекомендовано набирать значения для нормального референсного интервала в каждой конкретной лаборатории.

На рисунке Б хорошо видно, что все пациенты с подтвержденным дефицитом ПК имеют ее активность ниже нормы.

Чтобы дополнить характеристику разработанного метода определения активности ПК, следует упомянуть, что ранее мы показали, что его чувствительность и специфичность для диагностики дефицита ПК по отношению к другим гемолитическим анемиям, определенные при построении ROC-кривой для групп пациентов с генетически подтвержденным дефицитом ПК (n = 46) или другими гемолитическими анемиями (n = 62), оказались равны 91% и 95% соответственно при точке отсечения 8,44 МЕ/г Hb (AUC 0,98; 95% доверительный интервал 0,959; 0,995) [26].

Еще одной существенной особенностью ПК является то, что ее активность в ретикулоцитах пациентов с дефицитом уже сильно снижена. Это позволило нам предложить метод диагностики дефицита ПК по измерению ее активности в ретикулоцитах. Такое измерение можно проводить и через неделю после трансфузии донорских эритроцитов, так как к этому времени в крови пациентов уже не остается донорских ретикулоцитов, поэтому активность измеряется только в собственных ретикулоцитах пациента. Снижение этой активности однозначно говорит о наличии дефицита ПК [26].

Измерение активности гексокиназы

Дефициты других ферментов гликолиза, которые могут вызывать несфероцитарные НГА, встречаются гораздо реже. К таким ферментам относится и ГК.

Для определения референсного интервала нормальных значений активность ГК была измерена сначала в эритроцитах доноров (n = 53) (рисунок В). При этом интервал нормальных значений составил 0,68–1,11 МЕ/г Hb, медиана – 0,9 МЕ/г Hb. Если характеризовать результаты измерения активности ГК в эритроцитах доноров как среднее значение ± стандартное отклонение, то полученные значения составляют 0,89 ± 0,12 МЕ/г Hb (в работе E. Beutler [25] это значение составило 1,16 ± 0,17 МЕ/г Hb).

Из 2 представленных на рисунке В пациентов с генетически подтвержденным дефицитом ГК активность одного лежит ниже области нормальных значений (красная точка), а второго – на нижнем пределе этой области. Это связано, по-видимому, с тем, что у данного пациента активность была измерена вскоре после трансфузии донорских эритроцитов.

Измерение активности глюкозофосфатизомеразы

При разработке метода определения активности этого фермента также сначала был определен референсный интервал для доноров (n = 30) (рисунок Г). Величина интервала нормальных значений, включающего 95% всех измерений, составила 34,31–62,35 МЕ/г Hb. Медиана была равна 44,22 МЕ/г Hb, а среднее значение ± стандартное отклонение составляло 44,82 ± 5,56 МЕ/г Hb (в работе E. Beutler [25] эти значения были равны 60,8 ± 11,0 МЕ/г Hb). Пациентов, для которых была измерена активность ГФИ, было всего 5. Из них у 2 генетический анализ показал наличие мутаций, которые могут вызывать НГА в результате дефицита ГФИ, а у остальных генетический анализ не проводился. Один пациент (отмечен на рисунке Г красной точкой) имел гомозиготную мутацию с1028A>G, у другого была компаунд-гетерозиготная мутация (c1028A>G и с214-8_214-3delinsG). Но у этого пациента (розовая точка) измерение активности проводили через 1 мес после трансфузии донорских эритроцитов. Это, по-видимому, объясняет достаточно высокую активность ГФИ (на нижней границе нормы), измеренную у данного пациента. Данный вывод подтверждается также тем, что у обоих родителей этого пациента измеренная активность ГФИ была примерно в 2 раза ниже нормальной (голубые точки на рисунке Г). Подобного снижения активности, по-видимому, недостаточно, чтобы оно проявилось клинически.

Таким образом, разработанный метод анализа активности ГФИ является высокочувствительным и специфичным.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

НГА – это группа заболеваний, вызываемых различными генетическими нарушениями в структуре и стабильности гемоглобинов (гемоглобинопатии), мембран эритроцитов (мембранопатии) или отдельных ферментов гликолиза, пентозофосфатного пути, окислительного метаболизма или метаболизма нуклеотидов (энзимопатии) [1, 11]. Все эти дефекты приводят в конце концов к преждевременному разрушению эритроцитов (сокращению времени их жизни в организме из-за внутрисосудистого гемолиза или внесосудистого разрушения эритроцитов макрофагами в селезенке и печени). Настоящая работа посвящена разработке методов диагностики 3 наиболее часто встречающихся дефицитов ферментов гликолиза – ПК, ГФИ и ГК [22]. В литературе описаны также дефициты и других ферментов гликолиза, которые являются гораздо более редкими [3, 13, 22, 27].

Для выполнения своей основной физиологической функции (транспорт кислорода) и поддержания собственной жизнедеятельности эритроциту нужна энергия. Единственным источником этой энергии в эритроците является гликолиз (путь Эмбдена–Мейергофа), который обеспечивает в нормальных стационарных условиях 90% продукции АТФ, остальные 10% производятся в пентозофосфатном пути [3]. Дефициты ПК, ГФИ и ГК приводят к замедлению гликолиза и снижению синтеза АТФ. В результате страдают такие АТФ-зависимые функции эритроцитов, как поддержание нужного уровня гликолиза; работа ионных насосов, которые поддерживают объем эритроцитов и обеспечивают их способность деформироваться, от чего зависит выживание эритроцитов в кровотоке; защита белков эритроцита от окислительного повреждения активным кислородом; сохранение асимметрии липидного состава мембран эритроцитов и т. д. [27]. При этом преждевременная гибель эритроцитов при таких ферментопатиях чаще всего связана именно с их осмотическим лизисом из-за накопления метаболитов гликолиза, стоящих по потоку гликолиза выше, чем фермент со сниженной активностью [1].

Клинические признаки гемолитической анемии при ферментопатиях ферментов гликолиза достаточно общие и включают в себя нормоцитную и нормохромную анемию; снижение гематокрита, числа эритроцитов и/или концентрации гемоглобина в крови (< 12 г/дл), что приводит к гипоксемии; повышение ретикулоцитоза (как попытку организма адаптироваться к ускоренному выводу эритроцитов из кровотока); спленомегалию; повышение в крови концентрации неконъюгированного билирубина и уровня ЛДГ; снижение концентрации гаптоглобина, а также перегрузку железом, которая часто проявляется наличием желчнокаменной болезни [13, 22, 28, 29].

Тяжесть состояния (гемолиза) при дефицитах исследуемых ферментов варьирует в очень широких пределах от полностью скомпенсированной анемии, которая может оставаться недиагностированной многие годы и не требует специального лечения, до тяжелых состояний, когда пациент нуждается в постоянных трансфузиях донорских эритроцитов. При компенсированной и мягкой анемии никакого специального лечения не требуется. Пациенты со средней тяжестью могут получать только поддерживающую терапию (трансфузии донорских эритроцитов, профилактическую хелатную терапию для предотвращения побочных эффектов перегрузки железом). Однако в тяжелых трансфузионно зависимых случаях возможно применение спленэктомии, трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (если пациент не реагирует на спленэктомию) или (для дефицита ПК) введение низкомолекулярного синтетического аллостерического активатора ПК митапивата, который в настоящее время уже прошел III стадию клинических испытаний, где была продемонстрирована его эффективность. У 50% пациентов, принимавших препарат при лечении дефицита ПК, увеличивалась концентрация гемоглобина в крови и снижались уровни неконъюгированного билирубина и ретикулоцитов [9]. Патофизиология гемолиза в исследованной группе энзимопатий связана в основном с удалением эритроцитов макрофагами в селезенке, т. е. с внесосудистым гемолизом. Именно поэтому спленэктомия часто оказывается эффективной [6]. Ее нельзя назвать радикальным методом лечения, но она повышает уровень гемоглобина на 1–3 г/дл, что помогает избежать регулярного переливания эритроцитов, а также необходимости применения хелатотерапии для вывода избытка железа, что приводит к существенному улучшению качества жизни. Однако эффект спленэктомии вариабельный и его трудно предсказать заранее [22, 30]. Если пациент не отвечает на спленэктомию, то может быть рассмотрена другая терапевтическая стратегия (трансплантация гемопоэтических стволовых клеток или генная терапия) [22, 31, 32].

Основные сведения об исследованных в данной работе ферментах гликолиза приведены в таблице.

 

Таблица. Наиболее частые энзимопатии ферментов гликолиза, сопряженные с ними симптомы и возможный терапевтический эффект спленэктомии [3, 6, 13, 22]

Table. The most common glycolytic enzyme disorders, associated symptoms and the potential therapeutic effect of splenectomy [3, 6, 13, 22]

Дефицит фермента Enzyme deficiency	Остаточная активность, % Residual enzyme activity, %	Тяжесть гемолиза Severity of hemolysis	Симптомы, не связанные с эритроцитами Non-RBC-related symptoms	Спленэктомия/трансплантация гемопоэтических стволовых клеток Splenectomy/hematopoietic stem cell transplantation	Число описанных случаев (к 2021 г.) Number of reported cases (by 2021)
ПК PK	50–100	От мягкой до тяжелой Mild to severe	Перегрузка железом Iron overload	Спленэктомия при гиперспленизме, повышение гемоглобина до 10 г/л, возможна трансплантация гемопоэтических стволовых клеток Splenectomy for hypersplenism, hemoglobin elevation (up to 10 g/L), hematopoietic stem cell transplantation is possible	> 500 семей, > 400 мутаций > 500 families, > 400 mutations
ГФИ GPI	4–60	От мягкой до тяжелой Mild to severe	В некоторых случаях наблюдаются миопатии и нарушения центральной нервной системы In some cases, myopathies and central nervous system disorders	Эффективность спленэктомии неоднозначная Questionable effectiveness of splenectomy	> 50 семей, 31 мутация > 50 families, 31 mutations
ГК HK	17–180	От мягкой до тяжелой Mild to severe	Кратковременная аплазия костного мозга Transient bone marrow aplasia	Спленэктомия при гиперспленизме, эффективность неоднозначная, возможна трансплантация гемопоэтических стволовых клеток Splenectomy for hypersplenism, questionable effectiveness, hematopoietic stem cell transplantation is possible	20 случаев, 5 мутаций 20 cases, 5 mutations

 

Для исследуемых ферментов течение гемолитической анемии чаще всего хроническое. В отличии от НГА, вызываемых гемоглобинопатиями или мембранопатиями, для диагностики которых существует достаточно много различных инструментальных методов, энзимопатии можно диагностировать только путем прямого измерения активности данного фермента в крови [24, 30]. Тем не менее такой анализ не всегда может дать точный результат, подтверждающий наличие дефицита фермента. Причинами этого могут быть загрязнение исследуемого образца крови присутствующими в нем лейкоцитами, в которых активность исследуемого фермента гораздо выше, чем в эритроцитах, недавно проведенная трансфузия донорских эритроцитов, высокое содержание в образце ретикулоцитов, активность в которых также для многих ферментов гораздо выше, чем в эритроцитах [13, 33]. Однако в случае, если активность фермента снижена уже в ретикулоцитах, как это было показано для пациентов с дефицитом ПК [26], наличие высокого числа ретикулоцитов в крови может не влиять на общую измеряемую в крови активность данного фермента. Все это необходимо учитывать при проведении анализа.

Таким образом, установление причины НГА, связанной с ферментопатией, необходимо не только для постановки точного диагноза, но и для выбора стратегии терапии. При этом для точной постановки диагноза НГА, вызванной дефицитом определенного фермента гликолиза, сначала должны быть исключены из рассмотрения все другие гемолитические анемии (приобретенные, а также наследственные, связанные с нарушениями в гемоглобине и мембранах эритроцитов).

Если природа энзимопатии установлена (по снижению активности определенного фермента в крови), то следующий этап диагностики направлен на подтверждение этиологии НГА. На этом этапе используются молекулярные методы [23], которые, однако, тоже не всегда однозначны. В некоторых случаях обнаруживаются новые, ранее не описанные, генетические варианты неизвестного клинического значения, что подчеркивает важность исследования активности отдельных ферментов эритроцитов. Диагноз устанавливается на основании клинических, лабораторных и биохимических данных [23], что в очередной раз показывает важность комплексного исследования с использованием биохимических методов измерения активности фермента в крови и молекулярно-генетического анализа для диагностики несфероцитарных НГА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные в настоящем исследовании биохимические методы измерения активности гликолитических ферментов (ПК, ГФИ и ГК) высокочувствительны и специфичны, разработаны с учетом всех условий, влияющих на правильность проводимого анализа. Использование этих методов значительно облегчает дифференциальную диагностику НГА, вызванных дефицитами ферментов гликолиза, и делает эту диагностику соответствующей мировым стандартам.

ВКЛАД АВТОРОВ

И.А. Долгих: работа с данными, анализ данных, проведение исследования, написание черновика рукописи;

Л.Д. Колева: работа с данными, анализ данных, проведение исследования, визуализация;

Д.С. Прудинник, С.Г. Капранова (Манн): работа с данными, анализ данных, проведение исследования;

Ф.И. Атауллаханов: определение концепции, разработка методологии, руководство исследованием;

Н.С. Сметанина: разработка методологии, руководство исследованием;

Е.И. Синауридзе: определение концепции, разработка методологии, визуализация, работа с данными, анализ данных, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи, руководство исследованием.

Все авторы одобрили окончательный вариант рукописи.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

I.A. Dolgikh: data curation, formal analysis, investigation, writing – original draft;

L.D. Koleva: data curation, formal analysis, investigation, visualization;

D.S. Prudinnik, S.G. Kapranova (Mann): data curation, formal analysis, investigation;

F.I. Ataullakhanov: conceptualization, methodology, supervision;

N.S. Smetanina: methodology, supervision;

E.I. Sinauridze: conceptualization, methodology, visualization, data curation, formal analysis, writing – original draft, writing – review & editing, supervision;

All the authors approved the final version of the manuscript.

ЭТИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА

Исследование одобрено независимым этическим комитетом НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева (номер разрешения 1/6-2024). Все участники исследования (или их законные представители) подписали информированное согласие на проведение исследования.

ETHICS REVIEW

The study was approved by the Independent Ethics Committee of the D. Rogachev NMRCPHOI (Approval No. 1/6-2024). All the participants (or their legal representatives) signed an informed consent form for participation in the study.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено в рамках Государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации (регистрационный номер 125031003410-4).

FUNDING

The study was carried out as part of the State Assignment of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (registration No. 125031003410-4).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

CONFLICT OF INTEREST

The authors confirm that there is no conflict of interest to declare.

About the authors

I. A. Dolgih

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: andrei4rus@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-6738-9558

Research Technician at the Biophysics Laboratory

Russian Federation, Moscow

L. D. Koleva

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, the Russian Academy of Sciences

Email: andrei4rus@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8803-5694
Russian Federation, Moscow; Moscow

D. S. Prudinnik

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, the Russian Academy of Sciences

Email: andrei4rus@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5995-7702
Russian Federation, Moscow; Moscow

F. I. Ataullakhanov

Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, the Russian Academy of Sciences

Email: andrei4rus@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3403-181X
Russian Federation, Moscow

S. G. Kapranova (Mann)

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: andrei4rus@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1014-5196
Russian Federation, Moscow

N. S. Smetanina

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: andrei4rus@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2756-7325
Russian Federation, Moscow

E. I. Sinauridze

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, the Russian Academy of Sciences

Email: andrei4rus@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5948-3444
Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files