Whole-genome sequencing as a method for detecting chromosomal rearrangements in children with acute myeloid leukemia

Full Text

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) у детей представляет собой гетерогенную группу злокачественных новообразований кроветворной системы. Несмотря на относительно более низкую заболеваемость по сравнению с острым лимфобластным лейкозом (5–7 случаев на 1 млн детского населения в год), ОМЛ остается одной из наиболее сложных проблем детской онкогематологии. Современные протоколы терапии позволили повысить общую выживаемость до 70–75%, однако этот показатель по-прежнему существенно уступает результатам лечения острого лимфобластного лейкоза, где долгосрочная выживаемость превышает 90% [1].

Ключевым фактором оптимизации терапии является точная стратификация риска, основанная на выявлении специфических хромосомных аберраций и генных мутаций. При ОМЛ у детей структурные нарушения играют ведущую роль, обнаруживаясь у 75–80% пациентов. Основную долю составляют рекуррентные перестройки, включая нарушения KMT2A, RUNX1::RUNX1T1, CBFB::MYH11 и NUP98 [2]. Существенный вклад в патогенез также вносят несбалансированные изменения: анеуплоидии, делеции (например, del(5q), del(7q)), дупликации, а также сложные и моносомальные кариотипы, ассоциированные с крайне неблагоприятным прогнозом [3]. Значительно реже выявляются катастрофические геномные события (хромотрипсис, хромоплексия) и перестройки, приводящие к нарушению топологической архитектуры генома, включая события захвата энхансеров. Несмотря на низкую частоту, данные нарушения обладают выраженным прогностическим значением и нередко определяют резистентность к стандартной терапии [2]. Особую сложность представляет группа ОМЛ с цитогенетически нормальным кариотипом. Несмотря на отсутствие видимых аберраций при стандартном цитогенетическом анализе, применение высокоразрешающих методов позволяет выявлять у этих пациентов криптические варианты высокого риска, включая скрытые перестройки с участием KMT2A и NUP98 [4].

Диагностика хромосомных перестроек при остром миелоидном лейкозе у детей

Диагностика прогностически значимых хромосомных перестроек при детском ОМЛ исторически основана на последовательном применении методов с различной разрешающей способностью и диагностическим охватом и включает несколько взаимодополняющих этапов [4]. Первичный скрининг проводят с использованием стандартного кариотипирования и флуоресцентной гибридизации in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH), которые эффективны для выявления большинства известных крупных цитогенетических маркеров [3, 4]. Для быстрой верификации специфических химерных транскриптов и высокочувствительного мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР) [4]. Более углубленный молекулярный анализ обеспечивают таргетные NGS-панели, позволяющие параллельно исследовать десятки и сотни генетических локусов [5]. В совокупности данные методы позволяют выявлять большинство известных прогностических маркеров.

В то же время каждый из этих подходов обладает принципиальными ограничениями, которые становятся критичными в диагностически сложных случаях. Кариотипирование не выявляет криптические и субмикроскопические структурные варианты (structural variants, SV), эффективность FISH и таргетных NGS-панелей ограничена заранее определенным дизайном панелей, а методы на основе РНК дополнительно зависят от уровня экспрессии транскриптов [4, 6, 7]. В результате традиционный алгоритм не обеспечивает системного и непредвзятого анализа всего генома. Эти ограничения особенно значимы для ОМЛ с цитогенетически нормальным кариотипом, где высокоразрешающие методы нередко выявляют скрытые хромосомные перестройки, включая маркеры высокого риска с участием KMT2A, NUP98, MECOM и FUS::ERG [8–10].

Преодоление указанных диагностических пробелов требует перехода к непредвзятым широкогеномным подходам. В данном контексте полногеномное секвенирование (ПГС, whole genome sequencing, WGS) представляет собой наиболее универсальный инструмент, позволяющий в рамках единого исследования детектировать все основные классы геномных нарушений – однонуклеотидные варианты (single nucleotide variants) и небольшие инделы (indels), SV, изменения числа копий (copy number variants) [10]. Именно сочетание комплексности и независимости от предварительных гипотез делает ПГС ключевым методом для полноценной геномной характеристики детского ОМЛ [11].

Технология и этапы полногеномного секвенирования

ПГС направлено на определение нуклеотидной последовательности всего генома, включая как кодирующие, так и некодирующие области. В отличие от таргетных панелей и экзомного секвенирования, ПГС не требует предварительного обогащения мишеней, что гарантирует непредвзятость данных и отсутствие систематических ошибок дизайна. Использование протоколов с минимизацией ПЦР-амплификации (PCR-free) дополнительно уменьшает технологические артефакты и повышает точность детекции вариантов при достаточной глубине покрытия [12]. Важнейшим преимуществом перед РНК-секвенированием является независимость от уровня экспрессии генов, что критично для выявления структурно сложных перестроек в функционально инертных зонах генома [5, 11].

В клинической практике ПГС преимущественно реализуется на основе технологий секвенирования короткими прочтениями (short-read sequencing). Стандартный рабочий процесс включает фрагментацию ДНК, парноконцевое секвенирование (2 × 150 пар нуклеотидов) и комплексный биоинформатический анализ, позволяющий выявлять различные классы вариантов в рамках единого цикла [13] (рисунок).

 

Рисунок. Схема основных этапов ПГС и анализа SV

A – представлены ключевые этапы ПГС: фрагментация ДНК, лигирование адаптеров, амплификация библиотеки и секвенирование короткими парными прочтениями, выравнивание прочтений на референсный геном; Б – смещение и ориентация прочтений (S) относительно референса (R) используются для выявления SV. Парные прочтения (read pairs) – сигналы о делециях, инсерциях, дупликациях, инсерциях мобильных элементов; разделенные прочтения (split reads) – точное определение границ перестроек. Рисунок сделан самостоятельно с использованием программы BioRender (https://www.biorender.com)

Figure. A schematic representation of the main steps of whole-genome sequencing (WGS) and structural variant (SV) analysis

A – the key stages of WGS: DNA fragmentation, adapter ligation, library amplification, and paired-end short-read sequencing, read alignment to the reference genome; Б – the displacement and orientation of reads (S) relative to the reference genome (R) are used to identify SVs. Read pairs – signals for deletions, insertions, duplications and mobile element insertions; split reads – precise mapping of rearrangement breakpoints. The figure was created by the authors using the BioRender software (https://www.biorender.com)

 

Основным ограничением секвенирования short-read остается сравнительно небольшая длина прочтений, что затрудняет анализ высокоповторяющихся и структурно сложных регионов генома. Для преодоления этих ограничений активно развиваются технологии секвенирования длинными прочтениями и более полные референсные сборки, включая Telomere-to-Telomere (T2T-CHM13), однако на данный момент они остаются преимущественно исследовательскими инструментами и не внедрены в широкую клиническую практику [14].

Чувствительность и разрешение полногеномного секвенирования в детекции хромосомных перестроек

Чувствительность и разрешающая способность являются ключевыми валидационными параметрами любого диагностического метода. Для ПГС в контексте выявления хромосомных перестроек эти характеристики определяются совокупностью технологических и биоинформатических факторов:

1. Биологические особенности образца. Чувствительность детекции соматических перестроек напрямую зависит от доли опухолевых клеток и клональной архитектуры лейкоза. Например, при бластозе 50% перестройка, присутствующая в 10% опухолевых клеток, будет иметь частоту альтернативного аллеля (variant allele frequency, VAF) около 5%, что соответствует нижней границе обнаружения большинства биоинформатических пайплайнов [15, 16]. Наличие минорных субклонов (< 10%) повышает риск ложноотрицательных результатов при недостаточном покрытии. В связи с этим интерпретация данных ПГС должна проводиться в обязательной интеграции с цитоморфологическими данными и результатами многоцветной проточной цитометрии, что позволяет корректно соотнести геномные находки с долей опухолевых клеток в образце.
2. Качество ДНК и подготовка библиотеки. Для надежной детекции структурных вариантов критична сохранность высокомолекулярной ДНК. Деградация образца приводит к снижению эффективности выявления SV и затрудняет реконструкцию сложных перестроек. Оптимальными считаются значения индекса целостности DIN > 7 либо DV200 > 50–70% (% фрагментов длиной > 200 пар нуклеотидов для частично деградированных образцов). Химическая чистота ДНК должна соответствовать A260/280, равной 1,8–2,0, и A260/230 > 2,0, что гарантирует отсутствие ингибиторов ферментативных реакций. Количественная оценка ДНК должна выполняться флуориметрическими методами (например, Qubit), минимальный вход – около 100 нг. Оптимальная длина вставки библиотеки (350–450 пар нуклеотидов) обеспечивает эффективное перекрытие точек разрыва и повышает достоверность выявления транслокаций [17, 18].
3. Глубина покрытия и парный анализ. Глубина покрытия является одним из ключевых факторов, определяющих чувствительность ПГС. Для надежной детекции соматических SV при ОМЛ минимальным считается покрытие порядка 90–100×, однако для анализа субклональной архитектуры оптимальным диапазоном является 140–220× [18, 19]. Показано, что покрытие ≥ 140× позволяет достигать около 95% чувствительности для SV при низкой опухолевой клеточности и эффективно преодолевать порог 5% [20]. Использование парного нормального контроля (30–60×) является обязательным условием валидного анализа, позволяя отличать соматические перестройки от герминальных вариантов и артефактов, а также достигать предела обнаружения транслокаций на уровне 5–10% опухолевой клеточности [11, 19, 20].
4. Биоинформатический анализ и стратегии детекции. Современные алгоритмы биоинформатического анализа обеспечивают высокую чувствительность ПГС за счет интеграции нескольких независимых сигналов: выявления несогласованных пар ридов (discordant read pairs), анализа прерванных ридов (split reads), оценки вариаций глубины покрытия, а также использования алгоритмов локальной сборки de novo. Такой комбинированный подход позволяет выявлять как сбалансированные, так и сложные перестройки с высокой точностью. Для повышения специфичности широко применяются ансамблевые стратегии с использованием нескольких алгоритмов (например, Manta, DELLY, GRIDSS) и последующей фильтрацией с привлечением парного нормального контроля или Panel of Normals, что минимизирует число ложноположительных находок [21, 22].
5. Аналитическое разрешение и точность картирования. В отличие от классической цитогенетики, разрешение которой ограничено 5–10 Мб, ПГС обеспечивает детекцию точек разрыва с точностью до одного нуклеотида [18, 20]. Для сбалансированных перестроек (транслокаций, инверсий) точность картирования составляет 1–10 пар нуклеотидов при наличии достаточного количества прерванных прочтений (split reads). Для количественных изменений (copy number variations, CNV) разрешение варьирует в диапазоне от 10 до 50 тыс. пар нуклеотидов и напрямую зависит от равномерности покрытия и используемых статистических алгоритмов. Столь высокая детализация позволяет идентифицировать фокальные микроделеции и микродупликации, находящиеся за пределами разрешающей способности кариотипирования и FISH-анализа.

Сводные данные по аналитической чувствительности и разрешающей способности метода для основных классов прогностически значимых перестроек представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Аналитическая чувствительность и разрешающая способность метода ПГС в детекции различных типов SV при ОМЛ

Table 1. WGS analytical sensitivity and resolution for the detection of different SV types in acute myeloid leukemia (AML)

Тип перестройки Type of rearrangement	Примеры при ОМЛ Examples of rearrangements in AML	Ожидаемая чувствительность (предел обнаружения) Expected sensitivity (limit of detection)	Разрешение (точность картирования) Resolution (mapping precision)	Комментарии и ограничения метода Comments and method limitations
Сбалансированные транслокации Balanced translocations	Перестройки KMT2A RUNX1::RUNX1T1 PML::RARA KMT2A rearrangements RUNX1::RUNX1T1 PML::RARA	5–10% VAF (при 90–100×) 5–10% VAF (at 90–100× coverage)	1–10 пар нуклеотидов 1–10 base pairs	Превосходит стандартное цитогенетическое исследование, выявляет криптические химерные гены. Ограничение: центромерные и теломерные локусы с обилием повторов Superior to conventional cytogenetic analysis, it detects cryptic fusion genes. Limitations: centromeric and telomeric regions with abundant repeats
Инверсии Inversions	inv(16), inv(3)	5–10% VAF	1–10 пар нуклеотидов 1–10 base pairs	Эффективнее FISH за счет точного картирования точек разрыва в интронах More effective than FISH due to precise mapping of breakpoints in introns
Криптические и сложные перестройки Cryptic and complex rearrangements	MECOM, BCL11B, ETV6	5–10% VAF	1–10 пар нуклеотидов 1–10 base pairs	Позволяет выявить перестройки без образования химерного гена с точным определением точек разрывов Enables the detection of rearrangements that do not result in gene fusions, with precise mapping of breakpoints
CNV (делеции, анеуплоидии) CNVs (deletions, aneuploidies)	del(5q), del(7q), моносомия 7, +8 del(5q), del(7q), monosomy 7, +8	От 5–10 до 10–15% (> 1 Мб)* 5–10 to 10–15% (> 1 Mb)*	От 1–10 до десятков–сотен пар нуклеотидов** 1–10 to dozens and hundreds of base pairs**	Позволяет точно определить границы делеций. Для анеуплоидий разрешение ограничено размером окна (bin size) Enables precise mapping of deletion breakpoints. For aneuploidies, WGS resolution is limited by bin size
Сложные SV и хромотрипсис Complex SVs and chromothripsis	Каскадные перестройки, тандемные дупликации (FLT3-ITD, UBTF-TD) Cascading rearrangements, tandem duplications (FLT3-ITD, UBTF-TD)	От 5–10 до 10–20% VAF* 5–10 to 10–20% VAF*	От 1–10 до десятков–сотен пар нуклеотидов** 1–10 to dozens and hundreds of base pairs**	«Золотой стандарт» для реконструкции «геномных катастроф» и каскадных событий. Ограничение: тандемные дупликации большого размера (сотни пар нуклеотидов) сложны для коротких прочтений The “gold standard” for reconstructing “genomic catastrophes” and cascading events. Limitations: large tandem duplications (hundreds of base pairs) are challenging for short-read sequencing

Примечание. ^* – чувствительность для CNV и сложных структурных вариаций зависит от уровня «шума» в данных, глубины покрытия и чистоты опухолевой популяции в образце; ^** – разрешающая способность метода зависит от глубины покрытия и чистоты опухолевой популяции, для крупных анеуплоидий разрешение дополнительно ограничено размером аналитического окна (bin size) при биоинформатическом анализе.

Note. VAF – variant allele frequency; CNV – copy number variation. ^* – sensitivity for CNVs and complex structural variants depends on the level of noise in the data, sequencing depth, and the purity of tumor population in the sample; ^** – the resolution of the method depends on sequencing depth and tumor population purity; for large aneuploidies, the resolution is additionally limited by the bin size used in bioinformatic analysis.

 

Вклад полногеномного секвенирования в понимание молекулярного ландшафта детского острого миелоидного лейкоза

Становление ПГС как инструмента в онкогематологии стало возможным благодаря технологическому прогрессу, последовавшему после завершения проекта «Геном человека» (2003 г.) [23]. Публикация первого полного генома пациента с ОМЛ в 2008 г. продемонстрировала принципиальную возможность комплексного выявления соматических генетических изменений в рамках одного исследования, что стало отправной точкой для масштабного применения ПГС в исследованиях злокачественных новообразований крови [24].

Первые применения ПГС при детском ОМЛ были реализованы в рамках крупных консорциумных инициатив, прежде всего проектов Pediatric Cancer Genome Project и Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments (TARGET), запущенных в конце 2000-х – начале 2010-х годов. Эти исследования показали, что детский ОМЛ обладает уникальным молекулярным ландшафтом по сравнению со взрослым: при низкой общей мутационной нагрузке он характеризуется высокой частотой хромосомных перестроек и химерных генов [2, 25].

Накопленные в рамках этих проектов данные и методологические решения создали предпосылки для следующего этапа – анализа больших, клинически аннотированных когорт. Это привело к реализации инициативы TARGET AML, ставшей первым крупномасштабным консорциумным исследованием, целенаправленно посвященным системному описанию молекулярного ландшафта детского ОМЛ и его клинико-биологической стратификации, реализованный совместно Children’s Oncology Group и Национальным институтом рака США [2].

Ключевым исследованием этого этапа стала работа Bolouri и соавт. (2018), представившая наиболее комплексное на тот момент описание молекулярного ландшафта детского ОМЛ. В него были включены дети и молодые взрослые (n = 1023) в возрасте от 8 дней до 39 лет (медиана – 10 лет), получавших лечение по протоколам Children’s Oncology Group; для 993 пациентов были доступны полные клинические данные и сведения об исходах. Методологически работа основывалась на интегративном подходе, в том числе включавшем ПГС для 197 парных образцов опухоль/ремиссия. Высокая конкордантность между методами подтверждала надежность полученных данных: более 70% SNV и инделов, выявленных при ПГС, воспроизводились при таргетном секвенировании, а около 90% структурных вариантов были валидированы стандартными цитогенетическими и молекулярными методами. Одним из ключевых результатов этого исследования стало системное количественное описание возрастной динамики молекулярного ландшафта детского ОМЛ. Было показано, что доминирование SV над SNV формирует четкий возрастной градиент с выделением 3 молекулярно различимых подгрупп: младенцев (до 3 лет), детей (3–14 лет) и подростков/молодых взрослых (15–39 лет). Для младенческого ОМЛ характерно максимальное соотношение SV/SNV, тогда как с увеличением возраста наблюдается постепенный сдвиг в сторону накопления точечных мутаций, преимущественно в генах сигнальных путей [2, 26].

Расширение спектра структурных вариантов и химерных генов

Дальнейшие исследования с использованием ПГС существенно расширили перечень геномных нарушений детского ОМЛ, выявив множество ранее не описанных изменений. В исследовании Noort и соавт. ПГС применяли к когорте пациентов (n = 156) без известных драйверных событий, у 45% из которых были обнаружены клинически значимые перестройки, включая 22 ранее не описанные, в том числе с вовлечением ERG и NPM1 [27]. Открытие структурных вариантов NPM1 особенно значимо, поскольку ранее этот ген связывали преимущественно с точечными мутациями. Последующие функциональные анализы показали, что такие перестройки приводят к сверхэкспрессии HOX, фенотипически повторяя эффекты мутаций [27].

Cheng и соавт. выявили новые функционально значимые химерные гены, включая RUNX1::ERG, G3BP1::CSF1R и STIM1::MXD3. Причем STIM1::MXD3, возникший вследствие криптической транслокации t(5;11)(q35;p15), как было показано в дальнейшем, приводил к активации MYC-зависимых программ, в отличие от RUNX1::ERG, ассоциированного с их подавлением [28]. С помощью ПГС впервые были описаны редкие, но прогностически значимые структурные варианты, активирующие BCL11B и кластеры HOX через захват энхансера. Сложная архитектура этих перестроек, часто затрагивающих некодирующие регионы и отдаленные регуляторные элементы, делала их невозможными для обнаружения стандартными методами [29, 30].

Применение ПГС существенно расширило спектр партнеров для ключевых генов-драйверов при ОМЛ. Были идентифицированы десятки новых, в том числе уникальных, перестроек с участием KMT2A (USO1, NRIP3), NUP98 (ASH1L, BPTF), MLLT10 (MYO1F) и RUNX1 (SLTM, CHD1) [31–36]. Кроме того, ПГС позволило идентифицировать вариантные точки разрыва даже в канонических перестройках, таких как BCR::ABL1. Выявление атипичных разрывов, выходящих за пределы стандартных кластеров (cluster regions), имеет критическое значение для диагностики, так как подобные варианты часто оказываются недоступны для верификации методами ПЦР [37].

Новые классы геномных событий

Наряду со сбалансированными транслокациями, ПГС позволило детально описать ландшафт фокальных делеций и субмикроскопических изменений числа копий генов, играющих критическую роль в патогенезе детского ОМЛ. В частности, Bolouri и соавт. идентифицировали рекуррентные делеции, затрагивающие гены MBNL1, ZEB2 и ELF1. Было установлено, что данные события высокоспецифичны для пациентов младших возрастных групп и практически всегда сочетаются с перестройками KMT2A. Подобная взаимосвязь указывает на биологическую синергию: делеции выступают в роли необходимых кооперирующих событий, которые закрепляют программу самообновления клеток в специфическом эпигенетическом контексте, формируемом химерными белками семейства KMT2A [2, 26]. Специфические паттерны кооперирующих изменений были также обнаружены при редких подтипах заболевания. Так, в рамках группы NUP98::KDM5A данные ПГС продемонстрировали потерю хромосомы 13, включающей локус гена RB1, в 86,3% случаев [38]. Подобная высокая частота свидетельствует о биологической необходимости инактивации контроля клеточного цикла для реализации лейкемогенного потенциала химерного белка. Аналогичным образом использование ПГС позволило выявить гетерозиготные делеции региона гена IL9R, которые специфично ассоциированы с мутациями KIT и транслокацией (8;21) (2,26). Эти находки отражают уникальные паттерны сочетанных геномных изменений, характерных для CBF-ОМЛ, и подчеркивают сложность молекулярного ландшафта заболевания, где комбинация первичных драйверов и специфических делеций определяет биологическое поведение опухоли.

Исследование Cheng и соавт. выявило рекуррентные изменения числа копий, обладающие потенциальной прогностической ценностью. В частности, делеции генов PTPN11 и CHEK2 были обнаружены в 14% случаев (21 из 147 пациентов). Особенно интересны делеции PTPN11, поскольку активирующие мутации этого гена также характерны для детского ОМЛ, позволяя предположить, что как мутации с приобретением функции, так и делеции с потерей функции могут способствовать лейкемогенезу через различные механизмы [28].

ПГС позволило идентифицировать ряд новых рекуррентных генетических событий, ранее не распознававшихся как драйверные. Так, впервые при детском ОМЛ были описаны тандемные дупликации UBTF (UBTF-TD) – ключевого регулятора транскрипции РНК-полимеразы I. В работе Noort и соавт. они встречались у 10 из 156 пациентов и определяли отдельную неблагоприятную молекулярную подгруппу, в связи с гиперэкспрессией HOXA [27].

ПГС также обнаружило новые классы мутаций FLT3, специфичные для детей и отличные от канонических вариантов (FLT3-ITD и FLT3-TKD) [2, 26]. Эти так называемые FLT3.N-мутации (от англ. novel/other), включающие широкий спектр ранее не описанных точечных замен и малых инсерций–делеций вне «горячих точек», обладают выраженными активирующими свойствами. Функциональные исследования подтверждают их способность индуцировать лиганд-независимую передачу сигнала, что делает данные нарушения потенциальными мишенями для таргетной терапии ингибиторами тирозинкиназ.

Помимо идентификации новых независимых драйверных событий ПГС позволило детально охарактеризовать кооперативные геномные изменения в рамках известных молекулярных подтипов. В частности, у пациентов с CBF-ОМЛ были описаны внутренние тандемные дупликации гена MYC (MYC-ITD), представляющие собой частые структурные варианты, преимущественно ассоциированные с inv(16) и реже с t(8;21). Несмотря на высокую частоту MYC-ITD в этом подтипе, их наличие не сопровождалось однозначным ухудшением прогноза. Напротив, по сравнению с активирующими MYC SNV/indel, которые преимущественно выявляются в неблагоприятных молекулярных контекстах (FLT3-ITD, WT1, NUP98::NSD1), MYC-ITD при CBF-ОМЛ ассоциировались с более благоприятными клиническими исходами в ряде когорт, что подчtркивает контекст-зависимый эффект различных механизмов активации MYC [39].

Переосмысление классификации острого миелоидного лейкоза

На основании этих данных стало очевидным, что значительная часть молекулярных подтипов детского ОМЛ не укладывается в рамки действующих классификаций Всемирной организации здравоохранения ВОЗ (2022 г.) и Международной консенсусной классификации (International Consensus Classification, ICC) (2022 г.), валидация которых проводилась преимущественно на взрослых когортах. Клинически значимые подтипы, такие как лейкозы с UBTF-TD, структурными вариантами BCL11B или слияниями генов семейства ETS (например, FUS::ERG), зачастую попадают в обобщенные категории (например, «ОМЛ с другими генетическими изменениями»), что размывает границы между биологическими подтипами, делая стандартную прогностическую оценку недостаточно специфичной для разработки персонализированных терапевтических подходов. По оценкам, до 20–25% случаев не могут быть однозначно классифицированы в рамках существующих систем [31, 40]. В 2025 г. Umeda и соавт. предложили новую молекулярную классификацию детского ОМЛ на основе интегрированного анализа 887 случаев, включающего впервые выявленные ОМЛ и рецидивы. Сравнение ПГС, полноэкзомного- и РНК-секвенирования подтвердило преимущество ПГС в детекции криптических и сложных структурных вариантов, однако ключевым результатом стало выделение 23 взаимоисключающих подтипов, определяемых драйверными событиями. Эта схема охватила 91,4% когорты и включила ранее не признанные самостоятельными подтипами категории, включая UBTF и GLIS и др. На основе этих молекулярных категорий в сочетании с оценкой МОБ была предложена новая прогностическая схема, превосходящая традиционные подходы [32].

Следует подчеркнуть, что данная классификация носит исследовательский характер и в настоящее время не интегрирована в официальные диагностические рекомендации, тем не менее она демонстрирует потенциал широкогеномных методов в систематизации детского ОМЛ и подчеркивает наличие «серых зон», не охваченных текущими системами. Сравнительный обзор нозологических единиц ВОЗ/ICC и вновь описанных подтипов приведен в таблице 2.

 

Таблица 2. Сопоставление нозологических единиц ОМЛ в классификации ВОЗ и ICC и статус вновь описанных молекулярно-генетических подтипов

Table 2. A comparison of AML definitions between the World Health Organization (WHO) Classification and the International Consensus Classification (ICC) and the status of newly described molecular genetic subtypes

Категория Category	ВОЗ-2022 WHO 2022	ICC-2022 ICC 2022
I. Утвержденные клинические категории I. Established clinical categories
ОМЛ с химерными генами AML with fusion genes
t(15;17)(q24;q21)/PML::RARA	√	√
t(8;21)(q22;q22)/RUNX1::RUNX1T1	√	√
inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22)/CBFB::MYH11	√	√
t(6;9)(p23;q34)/DEK::NUP214	√	√
t(1;22)(p13;q13)/RBM15::MKL1	√	√
t(9;22)(q34;q11)/BCR::ABL1	√	√
11q23/перестройки KMT2A 11q23/KMT2A rearrangements	√	√
t(3;3)(q21;q26), inv(3)(q21q26)/перестройки MECOM t(3;3)(q21;q26), inv(3)(q21q26)/MECOM rearrangements	√	√
t(5;11)(q35;p15), t(7;11)(p15;p15)/перестройки NUP98 t(5;11)(q35;p15), t(7;11)(p15;p15)/NUP98 rearrangements	√	√
ОМЛ с соматическими мутациями AML with somatic mutations
Мутация NPM1 NPM1 mutation	√	√
Мутации CEBPA CEBPA mutations	√	√
Мутация TP53* TP53 mutation*	–	√
Прочие категории Other categories
t(1;3)(p36;q21)/PRDM16::RPN1*	–	√
ОМЛ, ассоциированный с миелодисплазией AML, myelodysplasia-related	√	√
ОМЛ с другими генетическими изменениями AML with other genetic alterations	√	√
II. Исследовательские категории II. Provisional categories
UBTF-TD**	–	–
Перестройки семейства ETS (t(16;21)(p11;q22)/FUS::ERG) ETS family rearrangements (t(16;21)(p11;q22)/FUS::ERG)	–	–
Перестройки семейства HOX HOX family rearrangements	–	–
Перестройки 14q32/BCL11B 14q32/BCL11B rearrangements	–	–
t(8;16)(p11;p13)/KAT6A::CREBBP	–	–
inv(16)(p13.3q24.3)/CBFA2T3::GLIS2	–	–
t(7;12)(q36;p13)/MNX1::ETV6	–	–
t(10;11)(p13;q21)/PICALM::MLLT10	–	–
CBFB-GDXY***	–	–
RUNX1::RUNX1T1-like	–	–
Изменения GATA1 GATA1 alterations	–	–
KMT2A-PTD****	–	–

Примечание. TD – тандемная дупликация; PTD – частичная тандемная дупликация. ^* – включен только в классификацию ICC; ^** – исследовательские категории представляют собой вновь описанные молекулярно-генетические подтипы ОМЛ, которые не вошли в утвержденные клинические классификации ВОЗ-2022 и ICC-2022, но имеют предварительные доказательства клинико-биологической значимости; ^*** – вставка GDXY-фрагмента – альтернативный механизм нарушения гена CBFB; ^**** – частичная тандемная дупликация гена KMT2A.

Notes. TD – tandem duplication; PTD – partial tandem duplication. ^* – included only in the ICC classification; ^** – provisional categories are newly described molecular genetic subtypes of AML that are not included in the established WHO 2022 and ICC 2022 classifications but are supported by preliminary evidence of clinical and biological significance; ^*** – the insertion of a GDXY fragment – an alternative mechanism of CBFB disruption; ^**** – partial tandem duplication of the KMT2A gene.

 

Понимание клональной эволюции и резистентности

ПГС пар образцов «диагноз–рецидив» предоставило уникальное понимание эволюции детского ОМЛ и механизмов устойчивости к лечению. Исследования показали, что при рецидиве мутационная нагрузка возрастает, а клональная архитектура опухоли существенно меняется [3, 31]. Это отражает как накопление новых соматических изменений, так и селекцию терапией устойчивых клонов. При рецидиве происходит обогащение отдельных мутаций (например, в FLT3), а также выявляются дополнительные рекуррентные нарушения, включая UBTF-TD и мутации MEN1, ассоциированные с лекарственной резистентностью [41, 42]. Кроме того, геномная характеристика рецидивных образцов демонстрирует повышенную частоту молекулярных подгрупп высокого риска – перестроек KMT2A (26,5%), NUP98 (13,2%), мутаций WT1 (24,3%), а также редких, но агрессивных вариантов с вовлечением MECOM и BCL11B [29]. Эти данные указывают на предпочтительную селекцию наиболее резистентных клонов и имеют важное значение для понимания механизмов рецидива и поиска новых терапевтических мишеней.

Повышение диагностической точности и мониторинг минимальной остаточной болезни

Данные, полученные в исследованиях у взрослых и детей с ОМЛ, убедительно демонстрируют, что интеграция ПГС в стандартный диагностический алгоритм существенно повышает выявляемость клинически значимых геномных событий. По сравнению с традиционной цитогенетикой ПГС позволяет обнаружить дополнительные изменения у порядка 15–25% пациентов, особенно в группе с цитогенетически нормальным кариотипом, где выявляются криптические перестройки высокого риска (например, перестройки KMT2A, NUP98, ETV6), приводящие к пересмотру категории риска и потенциальному изменению тактики лечения [43, 44].

В детских когортах интегрированный анализ, сочетающий ПГС и секвенирование транскриптома, выявляет широкий спектр ранее недиагностируемых событий, включая малые FLT3-ITD, фокальные делеции и дупликации, а также сложные структурные варианты, такие как частичные тандемные дупликации KMT2A (KMT2A-PTD), которые часто остаются незамеченными при использовании стандартных методов диагностики [45, 46].

ПГС также расширило возможности мониторинга МОБ. Подходы, основанные на точном определении индивидуальных точек разрыва ДНК, обеспечивают высокочувствительное отслеживание клональных популяций, ассоциированных со специфическими структурными вариантами и транслокациями. Эти методы демонстрируют существенные преимущества по сравнению с традиционными ПЦР-подходами в ряде клинических сценариев, особенно при редких или уникальных геномных перестройках, для которых отсутствуют коммерческие тест-системы. Применение ПГС-ориентированного мониторинга создает предпосылки для более раннего выявления молекулярного рецидива и разработки персонализированных стратегий консолидации и поддерживающей терапии [20, 31].

Клиническая имплементация: опыт внедрения и ограничения полногеномного секвенирования в онкогематологии

Клиническая значимость ПГС при ОМЛ у детей подтверждена рядом исследований, доказывающих возможность интеграции метода в реальную практику с соблюдением приемлемых сроков (turnaround time). ПГС не только расширяет молекулярный профиль опухоли, но и напрямую влияет на стратификацию риска и выбор терапии [41, 43, 44].

Первым крупным примером системного внедрения ПГС стал британский национальный проект «100 000 геномов» (Genomics England, 2012), стартовавший в 2012 г. Инициатива подтвердила не только техническую реализуемость метода в масштабах страны, но и его высокую прогностическую ценность [47]. К 2024 г. анализ результатов показал, что применение ПГС позволило выявить клинически значимые изменения у 50% пациентов с онкологическими заболеваниями. В частности, в 25% случаев ПГС предоставило информацию, критически важную для выбора таргетной терапии или изменения тактики лечения, которая была пропущена стандартными методами [47, 48]. Помимо этого, проект сформировал инфраструктурную и нормативно-правовую базу для создания первой в мире службы геномной медицины (NHS), интегрировав полногеномный анализ в рутинную онкогематологическую практику.

В детской онкогематологии данный подход был дополнительно развит в рамках специализированных исследовательских центров. Так, в St. Jude Children’s Research Hospital была внедрена и валидирована интегрированная платформа, сочетающая ПГС и транскриптомное секвенирование. В когорте пациентов с детским и подростковым ОМЛ (n = 154) данный подход продемонстрировал более высокую диагностическую информативность по сравнению со стандартными методами при высокой конкордантности результатов даже при умеренной глубине покрытия ПГС (в среднем– 61×) [49]. Интегрированный анализ превосходил традиционные методы в выявлении криптических химерных генов высокого риска (CBFA2T3::GLIS2 и перестройки NUP98), малых CNV, сложных инделов, FLT3-ITD и событий захвата энхансеров (MECOM, HOXA). Это позволило выполнить точную молекулярную классификацию в 91% случаев и привело к пересмотру прогностической группы у 16–25% пациентов, что подчеркивает клиническую значимость расширенного геномного профилирования. Дополнительно клинически значимые герминальные варианты были выявлены примерно у 13% пациентов, что имеет важные последствия для генетического консультирования и последующего наблюдения [49].

Критическим барьером для внедрения ПГС в рутинную практику долгое время считались длительные сроки обработки данных. Однако результаты многоцентрового исследования (Великобритания, 2023–2025 гг.) подтвердили эффективность протоколов сверхбыстрого ПГС (Ultra-Fast WGS) в детской онкогематологии. Среднее время до выдачи клинического заключения (turnaround time) было радикально сокращено до 3 дней, в то время как при использовании стандартных национальных программ секвенирования этот показатель достигал 37 дней. При конкордантности в 95% со стандартными тестами первой линии Ultra-Fast WGS обеспечил детекцию 19 дополнительных терапевтических мишеней. Таким образом, сокращение сроков ПГС до нескольких суток позволяет использовать метод как инструмент первичной диагностики для немедленного принятия решений о выборе таргетных препаратов [50].

Дополнительным подтверждением реализуемости ПГС на системном уровне служат международные инициативы по его интеграции в клиническую практику. В Австралии (проект Zero Childhood Cancer) и Нидерландах (Prinses Maxima Centrum) ПГС используется как диагностическая платформа для выявления молекулярных драйверов и потенциальных терапевтических мишеней у детей с онкологическими заболеваниями. Возможность стандартизированного применения ПГС в рамках национальной системы здравоохранения также продемонстрирована программой Genomic Medicine Sweden. Аналогичные подходы реализуются в японских кооперативных протоколах (JCCG/JPLSG AML-12/AML-D11). Интеграция ПГС в диагностические алгоритмы позволяет уточнять прогностическую стратификацию и принимать решения о персонализированной терапии, включая показания к высокодозному лечению и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток уже на этапе первичной диагностики [51, 52].

Системные ограничения и барьеры для широкого внедрения

Несмотря на доказанную клиническую полезность, внедрение ПГС в рутинную диагностику детского ОМЛ сопряжено с рядом системных ограничений, выходящих за рамки исключительно технологических аспектов. Эти барьеры затрагивают экономические, инфраструктурные, аналитические, интерпретационные и организационно-нормативные уровни и в совокупности определяют текущие границы клинической реализуемости ПГС.

В отличие от таргетных NGS-панелей или отдельных цитогенетических методов, ПГС требует значительных финансовых затрат и развитой вычислительной инфраструктуры, включая ресурсы для хранения, обработки и долгосрочного архивирования больших объемов данных. Одновременно с этим аналитические возможности ПГС не являются универсальными: при стандартных глубинах покрытия метод уступает глубокому таргетному секвенированию в чувствительности к низкоклональным вариантам и сталкивается с трудностями при анализе высокогомологичных участков генома и сложных повторных регионов.

Существенным ограничивающим фактором остается и интерпретационная сложность полногеномных данных. ПГС выявляет большое число вариантов неопределенного клинического значения, особенно в некодирующих областях, что требует высокой экспертизы в клинической биоинформатике и участия мультидисциплинарных команд. Дефицит подготовленных специалистов и отсутствие унифицированных интерпретационных стандартов могут существенно замедлять внедрение метода в рутинную практику.

Наконец, важную роль играют организационные и нормативные аспекты, включая увеличение сроков получения полного клинического отчета, необходимость регламентации работы с герминальными находками и отсутствие единых стандартов отчетности и правового статуса ПГС как диагностического теста. В совокупности эти факторы подчеркивают, что успешная интеграция ПГС требует не только технологической готовности, но и системных изменений на уровне клинических протоколов, инфраструктуры и регуляторной среды.

Пути интеграции полногеномного севенирования в рутинную клиническую практику

Преодоление выявленных барьеров требует поэтапного и системного подхода. Наиболее реалистичными стратегиями являются:

1. Поэтапное внедрение по клиническим показаниям – при диагностически сложных случаях (ОМЛ с нормальным кариотипом, рецидивные и рефрактерные формы).
2. Централизация и стандартизация – создание сети референс-лабораторий с валидированными биоинформатическими пайплайнами.
3. Формирование мультидисциплинарных команд – развитие системы экспертных советов по молекулярной диагностике опухолей (molecular tumor board) и образовательных программ для клиницистов.
4. Правовая и этическая гармонизация – разработка стандартов информированного согласия, интерпретации герминальных находок и хранения данных.

Таким образом, ПГС постепенно утрачивает статус исключительно исследовательского инструмента и становится ключевым элементом персонализированной диагностики детского ОМЛ. Успешная интеграция ПГС в рутинную практику определяется не столько технологической готовностью, сколько решением системных задач – экономических, кадровых, инфраструктурных и нормативных. Опыт первых клинических внедрений убедительно демонстрирует, что этот путь является не только необходимым, но и практически реализуемым.

ВКЛАД АВТОРОВ

К.Р. Ильясова: определение концепции, сбор и анализ литературы, написание черновика рукописи;

Р.Х. Абасов, М.А. Масчан: пересмотр и редактирование рукописи;

Е.А. Зеркаленкова: определение концепции, пересмотр и редактирование рукописи.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

K.R. Ilyasova: conceptualization, literature selection and analysis, writing – original draft;

R.Kh. Abasov, M.A. Maschan: writing – review & editing;

E.A. Zerkalenkova: conceptualization, writing – review & editing.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

FUNDING

No funding was received for this study.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

CONFLICT OF INTEREST

The authors confirm that there is no conflict of interest to declare.

About the authors

K. R. Ilyasova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: carinaisvv0206@icloud.com
ORCID iD: 0009-0003-3441-6397

MD in Clinical Laboratory Medicine at the Laboratory of Cytogenetics and Molecular Genetics

Russian Federation, Moscow

R. K. Abasov

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: carinaisvv0206@icloud.com
ORCID iD: 0000-0001-9179-8430
Russian Federation, Moscow

M. A. Maschan

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: carinaisvv0206@icloud.com
ORCID iD: 0000-0003-1735-0093
Russian Federation, Moscow

E. A. Zerkalenkova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: carinaisvv0206@icloud.com
ORCID iD: 0000-0001-9634-5828
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files