The diagnostic value of whole-genome sequencing and its role in risk stratification of children treated under the AML-MRD-2018 protocol

Karina R. Iliasova; Ильясова Карина Раидовна; R. Kh. Abasov; Абасов Р. Х.; E. V. Matveev; Матвеев Е. В.; A. B. Itov; Итов А. Б.; A. N. Kazakova; Казакова А. Н.; V. A. Kozeev; Козеев В. А.; A. M. Popov; Попов А. М.; S. A. Plyasunova; Плясунова С. А.; M. Kh. Gurzhikhanova; Гуржиханова М. Х.; D. A. Venyov; Венев Д. А.; I. I. Kalinina; Калинина И. И.; G. A. Novichkova; Новичкова Г. А.; A. A. Maschan; Масчан А. А.; M. A. Maschan; Масчан М. А.; E. A. Zerkalenkova; Зеркаленкова Е. А.

doi:10.24287/j.1119

The diagnostic value of whole-genome sequencing and its role in risk stratification of children treated under the AML-MRD-2018 protocol

Authors: Iliasova K.R.¹, Abasov R.K.¹, Matveev E.V.¹, Itov A.B.¹, Kazakova A.N.¹, Kozeev V.A.¹, Popov A.M.¹, Plyasunova S.A.¹, Gurzhikhanova M.K.¹, Venyov D.A.¹, Kalinina I.I.¹, Novichkova G.A.¹, Maschan A.A.¹, Maschan M.A.¹, Zerkalenkova E.A.¹
Affiliations:
1. The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Issue: Vol 25, No 2 (2026)
Pages: 12-24
Section: ORIGINAL ARTICLES
Submitted: 28.04.2026
Accepted: 13.05.2026
Published: 30.06.2026
URL: https://hemoncim.com/jour/article/view/1119
DOI: https://doi.org/10.24287/j.1119
EDN: https://elibrary.ru/GBZRGV
ID: 1119

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Risk stratification in pediatric acute myeloid leukemia (AML) is traditionally based on the detection of chromosomal rearrangements using conventional molecular cytogenetic methods. However, these approaches are limited in detecting structurally complex and new genomic alterations. Whole-genome sequencing (WGS) overcomes these limitations, ensuring detection of all types of structural variants and providing their comprehensive molecular characterization.

Aim: to evaluate the capabilities of WGS in identifying chromosomal rearrangements in children with AML treated under the AML-MRD-2018 protocol.

Materials and methods. Out of 723 patients enrolled in the AML-MRD-2018 protocol, 335 (46%) children aged 0–18 years (median age – 9 years) were included in the study. WGS was performed on the DNBSEQ-T7 platform (150 × 2), with a median sequencing depth of 112×. Structural variants were identified using the MANTA algorithm with subsequent verification using a genome visualizer and confirmation by polymerase chain reaction and Sanger sequencing.

Results. The results of WGS and standard testing methods were completely concordant in 228 (68%) out of 335 patients. WGS identified key stratifying translocations: KMT2Ar (n = 137; 41%), RUNX1::RUNX1T1 (n = 34; 10%), CBFB::MYH11 (n = 27; 8%), NUP98r (n = 19; 6%). In patients in whom standard methods had failed to detect markers, WGS revealed 26 rearrangements, including cryptic variants of KMT2A (n = 7), NUP98 (n = 5) and ERG rearrangements (n = 2), as well as rare fusion genes. Three novel fusion genes were identified. Overall, WGS provided additional clinically significant information in 40 cases, with an added diagnostic yield of 12%.

Conclusion. WGS effectively detects both recurrent and rare, cryptic, and structurally complex chromosomal rearrangements, while providing their thorough molecular characterization. The method allows for improved risk stratification and can serve as a basis for minimal residual disease monitoring, increasing diagnostic accuracy and the potential for treatment personalization.

Keywords

acute myeloid leukemia, children, whole-genome sequencing, fusion genes, structural rearrangements, risk stratification

Full Text

Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) у детей представляют собой гетерогенную группу злокачественных новообразований кроветворной системы. Несмотря на значительный прогресс в терапии, ОМЛ остается одной из ведущих причин смертности в детской онкогематологии [1]. Ключевым фактором, определяющим прогноз и выбор терапевтической стратегии, является генетический ландшафт опухолевого клона [2–4]. Современные протоколы лечения, включая ОМЛ-MRD-2018, основаны на стратификации риска с учетом специфических хромосомных аномалий и генных мутаций [5, 6]. При этом хромосомные перестройки выявляются примерно в 80% случаев и играют ключевую роль в патогенезе и прогнозировании течения заболевания [5].

В клинической практике стратификация риска базируется на результатах стандартных цитогенетических и молекулярно-генетических методов, включая кариотипирование, флуоресцентную гибридизацию in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH), полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и таргетное высокопроизводительное секвенирование (next-generation sequencing) [7]. Однако данные подходы имеют ряд ограничений. Кариотипирование требует получения жизнеспособных делящихся клеток и обладает ограниченной разрешающей способностью, что затрудняет выявление криптических и сложных перестроек [7]. Методы FISH и таргетного секвенирования позволяют анализировать лишь заранее выбранные участки генома, не обеспечивая полной картины структурных изменений [7, 8]. Вследствие этого часть клинически значимых аберраций, включая редкие варианты драйверных химерных генов, может оставаться недиагностированной, что приводит к потенциальной недооценке риска рецидива [5, 6].

Полногеномное секвенирование (ПГС) выступает как перспективный универсальный подход, позволяющий в рамках одного анализа выявлять все типы генетических изменений – от точечных мутаций до крупных структурных перестроек [9, 10]. Метод обеспечивает детекцию как известных, так и ранее не описанных химерных генов, недоступных стандартным диагностическим алгоритмам. Несмотря на снижение стоимости и рост доступности технологии, диагностическая эффективность ПГС в условиях реальных клинических протоколов лечения детского ОМЛ, а также его влияние на стратификацию риска остаются недостаточно изученными.

Целью настоящего исследования является оценка применимости ПГС для выявления клинически значимых соматических хромосомных перестроек у детей с ОМЛ в рамках протокола ОМЛ-MRD-2018, а также определение его диагностической эффективности и влияния на стратификацию риска с перспективой внедрения данного подхода в рутинную лабораторную практику.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты

В исследование были включены 369 образцов от 335 пациентов в возрасте от 0 до 18 лет с подтвержденным или предполагаемым диагнозом ОМЛ, в том числе 34 парных образца «инициально–рецидив», обследованных в ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России в период с июня 2018 г. по май 2025 г.

Материалом исследования являлись архивные препараты геномной ДНК, криоконсервированные мононуклеарные клетки, из которых выделяли нуклеиновые кислоты, а также свежие образцы костного мозга (КМ) и периферической крови, полученные до начала специфической терапии.

Критериями включения являлись первичная постановка диагноза или рецидив ОМЛ, наличие достаточного объема материала для проведения ПГС (минимум 50 000 клеток) и общее количество ДНК не менее 500 нг. Образцы с низким качеством нуклеиновых кислот или долей бластов/патологических клеток <10% исключались из анализа.

Стандартное цитогенетическое исследование и флуоресцентная гибридизация in situ

Клетки КМ или периферической крови культивировали без митогенной стимуляции (17–24 ч) с добавлением колхицина для остановки клеточного цикла на стадии метафазы. Хромосомы окрашивали методом G-полос с использованием красителя Райта (Wright’s stain) после предварительной обработки трипсином [11].

Поиск метафазных пластинок проводили с использованием программы Metafer (MetaSystems, ФРГ). Для анализа кариотипа применяли программу Ikaros Karyotyping Software (MetaSystems, ФРГ), анализировали не менее 20 метафазных пластинок. Результаты описывали в соответствии с Международной системой цитогеномной номенклатуры человека (International System for Human Cytogenomic Nomenclature, ISCN 2024) [12].

Для выявления стратифицирующих цитогенетических аберраций проводили исследование методом FISH с использованием коммерческих ДНК-зондов. Гибридизацию проводили согласно инструкциям производителей, после чего весь материал окрашивали красителем DAPI (Thermo Fisher Scientific, США). Визуализацию и анализ изображений выполняли с использованием программного обеспечения ISIS (MetaSystems, ФРГ). Результаты описывали в соответствии с ISCN 2024 [12].

Молекулярно-генетические методы

Выделение нуклеиновых кислот

РНК выделяли из мононуклеарных клеток КМ с помощью наборов RNeasy Kit (Qiagen, ФРГ) и HiPure Total RNA Kit (Magen Biotechnology, КНР) по стандартным протоколам. ДНК – с использованием innuPREP DNA/RNA Mini Kit (Analytik Jena AG, ФРГ) в соответствии с протоколами производителей. Качество и концентрацию нуклеиновых кислот оценивали спектрофотометром Thermo Scientific Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, США). Минимальные критерии качества: концентрация ДНК – ≥50 нг/мкл, соотношение A260/280 – 1,8–2,0, концентрация РНК – ≥20 нг/мкл, соотношение A260/280 – 1,8–2,1.

Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

Обратную транскрипцию РНК проводили с использованием обратной транскриптазы Mint и смеси случайных гексануклеотидов или дексануклеотидов (ЗАО «Евроген», Москва, Россия).

ПЦР выполняли с реактивом OneTaq 2x MM (NEB, США) на приборе CFX96 (BioRad, США), используя 0,5 мкМ праймеров и 0,3 мкМ TaqMan-зондов. Для контроля использовались положительные и отрицательные образцы.

Таргетное секвенирование

Таргетное секвенирование геномной ДНК осуществляли с использованием набора реагентов NEBNext Ultra™ II DNA Library Prep Kit (NEB, США) с последующим гибридизационным обогащением. Обогащение проводили с помощью таргетной ДНК-панели Illumina (Illumina, США). Секвенирование выполняли на платформе MiSeq (Illumina, США). Полученные данные анализировали с использованием стандартных биоинформатических пайплайнов, идентификацию вариантов проводили путем выравнивания на референсный геном человека (hg38) с использованием алгоритма BWA-MEM2 (Burrows-Wheeler Aligner с поиском максимальных точных совпадений (Maximal Exact Matches)) [13].

В ряде случаев для детекции химерных транскриптов выполняли высокопроизводительное секвенирование РНК (RNA-seq). Подготовку библиотек осуществляли с использованием набора реагентов Archer FusionPlex Myeloid Kit (Integrated DNA Technologies, США) в соответствии с протоколом производителя. Секвенирование проводили на платформе MiSeq (Illumina, США). Выравнивание прочтений выполняли на hg38, поиск химерных транскриптов осуществляли алгоритмом Arriba [14]. Для подтверждения структуры химерных генов и точной локализации точек разрыва дополнительно применяли программу парного выравнивания BLAST [15].

Полногеномное секвенирование

Подготовка библиотек и секвенирование проводились на базе ООО «Биотек Кампус» с использованием MGIEasy FS PCR-free DNA Library Prep Set (MGI, КНР). Секвенирование выполнялось на платформе DNBSEQ-T7 (MGI, КНР) методом парно-концевого чтения (150 × 2) со средней глубиной 100× и покрытием ≥98,7% при глубине ≥30×.

Обработка данных осуществлялась при помощи программ BWA-MEM2 (выравнивание на hg38) и DeepVariant (variant calling) [13, 16], аннотация и интерпретация vcf – с использованием программ VEP и VarSome [17, 18]. Выявление структурных вариантов осуществляли при помощи алгоритма MANTA [19]. Контроль качества включал проверку процента картированных прочтений, качества чтения и уровня дубликатов.

Валидация результатов

Для подтверждения перестроек, выявленных ПГС и не выявленных цитогенетическими методами, использовали ПЦР и секвенирование по Сэнгеру. ПЦР выполняли с использованием праймеров, расположенных вблизи точек разрыва структурных вариантов. Полученные продукты визуализировали, очищали и секвенировали на платформе ABI 3500 (ThermoFisher Scientific, США).

Результаты ПГС использовались для стратификации пациентов по генетическим группам риска с последующим сравнением со стратификацией, выполненной стандартными методами в рамках протокола ОМЛ-MRD-2018.

Статистический анализ

Данные обрабатывали с использованием программы GraphPad Prism (v.9.0). Описательная статистика представлена в виде абсолютных значений, процентов, медиан и диапазонов. Сравнение размера клона между группами проводили с помощью U-критерия Манна–Уитни. Сравнение частот криптических перестроек выполняли с использованием точного критерия Фишера. Сравнение частоты сложных перестроек проводили с помощью критерия χ² Пирсона. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выявляемость химерных генов стандартными методами

Из 335 пациентов, включенных в протокол ОМЛ-MRD-2018, химерный ген был обнаружен стандартными методами (кариотипирование, FISH, ПЦР, а также в отдельных случаях таргетное секвенирование) в 228 (68,1%) случаях. В этой группе преобладали 4 рекуррентные перестройки (перестройки, регулярно встречающиеся у большой группы пациентов): KMT2Ar – 137 (40,8%), RUNX1::RUNX1T1 – 4 (10,1%), CBFB::MYH11 – 27 (8,0%), NUP98r – 19 (5,7%).

Редкие рекуррентные перестройки (повторяющиеся перестройки с частотой встречаемости менее 5% в нашей когорте) выявлены в 10 (3%) случаях, включая PICALM::MLLT10 (n = 4), CBFA2T3::GLIS2 (n = 3), ETV6::NOM1 (n = 1), ETV6::MECOM (n = 1), ZMYND11::MBTD1 (n = 1). А также был выявлен новый химерный ген (уникальная, ранее не описанная в литературе перестройка) PML::RUNX1 (n = 1).

У 107 (31,9%) пациентов стандартные методы не выявили химерного гена. Среди них были выделены 2 подгруппы:

14 (13,1%) пациентов имели подозрение на наличие перестройки по данным цитогенетического анализа (хромосомные аномалии, характерные для рекуррентных транслокаций, но без молекулярного подтверждения);
93 (86,9%) пациента не имели подозрений на наличие перестройки (нормальный кариотип или аномалии, не ассоциированные с рекуррентными перестройками).

Дополнительная диагностическая ценность полногеномного секвенирования

Применение ПГС позволило:

в группе с ранее выявленными химерными генами (n = 228) – подтвердить все перестройки (100% конкордантность);
в группе с подозрением на наличие перестройки (n = 14; 4,2%) – идентифицировать точную молекулярную структуру химерного гена во всех случаях (таблица 1);

Таблица 1

Химерные гены, идентифицированные ПГС в группе с подозрением на наличие перестроек

Table 1

Fusion genes identified by WGS in the group with suspected rearrangements

Группа Group	Кариотип/FISH Karyotype/FISH	Уточненная категория ПГС Refined WGS category	Количество Number
Частые рекуррентные перестройки (n = 3) Common recurrent rearrangements (n = 3)	KMT2Ar	KMT2A::ZNF609,KMT2A::MRTFA	1
	NUP98r	NUP98::KMT2A	1
	NUP98r	NUP98::HOXD13	1
Редкие рекуррентные перестройки (n = 10) Rare recurrent rearrangements (n = 10)	CREBBPr	KAT6A::CREBBP	1
	ETV6r	ETV6::HIBADH	1
	HOXAr	6q21::HOXA11	1
	MECOMr	3q21.3::MECOM	1
	NPM1r	NPM1::CCDC28A	1
	t(5;6)(q33;q16)	NPM1::6q21	1
	t(5;17)(q35;q21	NPM1::AKAP1	1
	RUNX1r	RUNX1::HOXA10	1
	t(11;20)(q13;q11)	ZMYND8::RELA	1
	t(2;17)(q37;q21)	BCL11B::ARID1B	1
Новые (n = 1) Novel rearrangements (n = 1)	KMT2Ar(?)^*	MPZL2::MYO1D	1
Всего Total			14

Примечание. ^* – ввиду локализации гена-партнера MPZL2 в регионе 11q23 первоначально предполагалась перестройка KMT2A.

Notes. ^* – since the partner gene MPZL2 is located in the 11q23 region, a KMT2A rearrangement was initially suspected.

в группе без подозрений на наличие перестройки (n = 93; 27,7%) – выявить 26 (8%) химерных генов, ранее не детектированных стандартными методами (таблица 2);

Таблица 2

Химерные гены, идентифицированные ПГС в группе без подозрений на наличие перестроек

Table 2

Fusion genes identified by WGS in the group without suspected rearrangements

Группа Group	Кариотип/FISH Karyotype/FISH	Уточненная категория ПГС (n = 26) Refined WGS category (n = 26)	Количество Number
Частые рекуррентные перестройки (n = 12) Common recurrent rearrangements (n = 12)	Нет стратифицирующего маркера No stratifying marker	KMT2A::MLLT10 (5) KMT2A::AFDN (1) KMT2A::USP2 (1)	7
	Нет стратифицирующего маркера No stratifying marker	NUP98::NSD1	5
Редкие рекуррентные перестройки (n = 13) Rare recurrent rearrangements (n = 13)	Нет стратифицирующего маркера No stratifying marker	HOXA9/HOXA10::8q24.13 NIPBL::HOXB9 MED14::HOXA9 Xq13.1::HOXC9	4
		BCL11B::ARID1B	3
		DDX3X::MLLT10	1
		FUS::ERG ERG::HNRNPH1	2
		SQSTM1::NUP214	1
		NPM1::BCAT1	1
		ETV6::NOM1	1
Новые перестройки (n = 1) Novel rearrangements (n = 1)	Нет стратифицирующего маркера No stratifying marker	MSI2::NOM1	1
Химерный ген не обнаружен No fusion gene detected	Нет стратифицирующего маркера No stratifying marker	Химерный ген не обнаружен No fusion gene detected	67

в группе парных образцов «инициально–рецидив» (n = 34) – оценить стабильность хромосомных перестроек в динамике заболевания.

Важно отметить, что ПГС обеспечило уточнение молекулярной структуры перестроек, позволяя дифференцировать простые реципрокные транслокации с образованием 2 химерных генов от сложных вариантов, включающих несколько генов или геномных регионов (таблицы 3, 4).

Таблица 3

Характеристика перестроек в группе частых рекуррентных химерных генов (по данным ПГС)

Table 3

Characteristics of rearrangements in the group with common recurrent fusion genes (based on WGS findings)

Группа Group	Всего Total	Простые перестройки, n (%) Simple rearrangements, n (%)	Сложные перестройки, n (%) Complex rearrangements, n (%)	Максимальное число химерных генов Maximum number of fusion genes	Часто вовлекаемые дополнительные хромосомы Frequently involved additional chromosomes	Вторичные химерные гены/слияния Secondary fusions
KMT2Ar	145	80 (55,2)	65 (44,8)	17	1, 7, 12, 17, X	RUNX1, DDX10, USP32::USP6, ZNF232::PTGER2, ARRB1
RUNX1::RUNX1T1	34	27 (79,4)	7 (20,6)	6	4, 13, 3, 7, 10, 18	RIMS2::XIRP2, ENSG00000253322::DGKI, FOXO3::PDGFD
CBFB::MYH11	27	24 (88,9)	3 (11,1)	3	9	NF1::12p13.2, ATXN1::SEC22A
NUP98r	26	25 (96,2)	1 (3,8)	8	–	7p21.3::12q21.33, 1p31.1::1p13.2

Таблица 4

Сводная характеристика сложных перестроек

Table 4

The summary of characteristics of complex rearrangements

Группа Group	Общее количество сложных перестроек Total number of complex rearrangements	Число вовлеченных генов и регионов, диапазон Number of involved genes and genomic regions (range)	Максимальное число слияний Maximum number of fusions	Наиболее частый паттерн^* Most common pattern^*	Вовлечение дополнительных хромосом, % Involvement of additional chromosomes, %	Часто вовлекаемые дополнительные хромосомы Frequently involved additional chromosomes
KMT2A::MLLT10	27	3–17	17	10;11 (3 гена) – 44% 10;11 (3 genes) – 44%	37	1, 2, 5, 7, 8, 9, 16, 17, 21
KMT2A::MLLT3	13	3–9	9	9;11 (3 гена) – 38% 9;11 (3 genes) – 38%	46	7, 12, 17, 18
KMT2A::ELL	4	1–5	5	11;19 (3 гена) – 25% 11;19 (3 genes) – 25%	75	3, 4, 7, X
KMT2A::SEPTIN6	2	4–5	5	X;11 (4 гена) – 50% X;11 (4 genes) – 50%	50	3
RUNX1::RUNX1T1	6	3–6	6	8;21 (3 гена) – 50% 8;21 (3 genes) – 50%	50	4, 7, 10, 13, 18
CBFB::MYH11	3	3	3	16;16 (3 гена) – 67% 16;16 (3 genes) – 67%	33%	9

Примечание. ^* – наиболее часто встречающаяся комбинация вовлеченных хромосом и количество химерных генов в данной группе, например, «10;11 (3 гена)» означает, что в 44% случаев сложных перестроек KMT2A::MLLT10 вовлечены только хромосомы 10 и 11 с образованием 3 химерных генов). Вовлечение дополнительных хромосом наиболее часто наблюдалось при KMT2A::ELL (75%; хромосомы 3, 4, 7, X) и KMT2A::MLLT3 (46%; хромосомы 7, 12, 17, 18). При KMT2A::MLLT10 дополнительные хромосомы вовлекались в 37% случаев (хромосомы 1, 2, 5, 7, 8, 9, 16, 17, 21). В группе RUNX1::RUNX1T1 дополнительные хромосомы (4, 7, 10, 13, 18) выявлены в 50% случаев, при CBFB::MYH11 – в 33% (хромосома 9).

Notes. ^* – the most common combination of involved chromosomes and the number of fusion genes in each group is indicated (e.g., “10;11 (3 genes)” means that in 44% of complex KMT2A::MLLT10 rearrangements, only chromosomes 10 and 11 are involved, resulting in 3 fusion genes). The involvement of additional chromosomes was most frequently observed in KMT2A::ELL (75%; chromosomes 3, 4, 7, X) and KMT2A::MLLT3 (46%; chromosomes 7, 12, 17, 18). In KMT2A::MLLT10, additional chromosomes were involved in 37% of cases (chromosomes 1, 2, 5, 7, 8, 9, 16, 17, 21). In the RUNX1::RUNX1T1 group, additional chromosomes (4, 7, 10, 13, 18) were identified in 50% of cases, whereas in CBFB::MYH11, in 33% (chromosome 9).

Изучение таких сложных вариантов (n = 6; 18% от парных образцов) в динамике показало, что во всех проанализированных парных образцах (100%) исходная рекуррентная перестройка сохранялась при развитии рецидива. Так, стабильность комплексных перестроек с вовлечением 3 генов была зафиксирована у пациентов с PML::RUNX1 и KMT2A::MLLT10. У пациента с транслокацией RUNX1::RUNX1T1 комплексный характер перестройки (3 гена) стабильно сохранялся в сочетании с del9q. Даже в случаях экстремальной геномной сложности с образованием 6 химерных генов (с 2 партнерами KMT2A) и 10 химерных генов (у пациента с KMT2A::MLLT10 и дополнительным вовлечением RUNX1) структура перестроек осталась неизменной. Признаки клональной эволюции в рецидиве были обнаружены лишь в 1 клиническом наблюдении: на фоне сохранения исходной структуры KMT2A::MLLT10 с 4 химерными генами было зарегистрировано появление дополнительного молекулярного события 18q23::CUEDC1.

Распределение пациентов по генетическим подгруппам на основании стандартных методов и после применения ПГС представлено на рисунке 1.

Рисунок 1

Диаграмма потоков (Sankey plot), иллюстрирующая изменение диагностической категории пациентов после применения ПГС (n = 335)

Левая часть диаграммы отражает результаты стандартных методов диагностики (кариотипирование, FISH, ПЦР, таргетное секвенирование). Правая часть диаграммы – результаты ПГС. Потоки показывают перераспределение пациентов после применения ПГС. В группе «Другие» объединены химерные гены ZMYND11::MBTD1, KAT6A::CREBBP, 3q21.3::MECOM, ZMYND8::RELA, DDX3X::MLLT10, FUS::ERG, ERG::HNRNPH1, SQSTM1::NUP214. В группе «Новые» – химерные гены MPZL2::MYO1D, PML::RUNX1, MSI2::NOM1. У оставшихся 67 (20%) пациентов химерный ген не выявлен после ПГС. Диаграмма создана при помощи SankeyMATIC.com. Подозрение – есть подозрение на наличие перестроек по данным стандартных методов; без подозрений – нет подозрения на наличие перестроек по данным стандартных методов

Figure 1

Sankey plot illustrating changes in the patients’ diagnostic categories after whole-genome sequencing (WGS) (n = 335)

The left side of the diagram shows the results of standard diagnostic testing (karyotyping, fluorescence in situ hybridization (FISH), polymerase chain reaction (PCR), targeted sequencing). The right side reflects the results of WGS. The flows indicate patient redistribution after WGS. The “Other” group includes the following fusion genes: ZMYND11::MBTD1, KAT6A::CREBBP, 3q21.3::MECOM, ZMYND8::RELA, DDX3X::MLLT10, FUS::ERG, ERG::HNRNPH1, SQSTM1::NUP214. The “Novel” group includes the following fusion genes: MPZL2::MYO1D, PML::RUNX1, MSI2::NOM1. In the remaining 67 (20%) patients, no fusion genes were detected after WGS. The diagram was generated using SankeyMATIC.com. Suspected – suspected presence of rearrangements based on standard testing results; unsuspected – no evidence of rearrangements based on standard testing results

Причины расхождений между методами

Основными причинами расхождений между методами являлись криптический (скрытый) характер перестроек (n = 14) и ограниченные возможности стандартных диагностических панелей по выявлению ряда специфических молекулярных маркеров (n = 13). Анализ связи между размером клона по данным FISH и выявляемостью перестроек методом стандартного цитогенетического исследования (СЦГИ) не выявил прямой корреляции. В группе KMT2A и NUP98 все СЦГИ-негативные случаи характеризовались высоким процентом перестроенных ядер (до 90%), что не отличалось от СЦГИпозитивных случаев (p = 0,23; U-критерий Манна–Уитни). Напротив, в ряде СЦГИ-позитивных случаев (например, CBFB::MYH11) размер клона по FISH составлял всего 10–30%, но перестройки были успешно идентифицированы. Это объясняется структурными особенностями: криптические перестройки KMT2A и NUP98 часто возникают за счет теломерных обменов или инсерций, не меняющих морфологию хромосом, тогда как классические перестройки характеризуются грубыми изменениями, видимыми даже при малом размере клона.

Криптические перестройки чаще встречались в группе NUP98 (19,2%), чем в группе KMT2A (4,8%) (p = 0,025; точный критерий Фишера).

Сложные перестройки значительно чаще наблюдались при KMT2A (45%), чем при RUNX1::RUNX1T1 (20,6%), CBFB::MYH11 (11,1%) и перестройках NUP98 (3,8%) (p < 0,001, критерий χ²). Наибольшее разнообразие сложных перестроек отмечено в группе KMT2A::MLLT10 (27 случаев, диапазон – 3–17 генов), тогда как в группе KMT2A::MLLT3 сложные варианты встречались реже (13 случаев, до 9 генов). Для RUNX1::RUNX1T1 и CBFB::MYH11 сложные перестройки были единичными (7 и 3 случая соответственно). Вовлечение дополнительных хромосом наиболее часто наблюдалось при KMT2A::ELL (75%) и KMT2A::MLLT3 (46%). Вторичные химерные гены выявлены преимущественно в группе KMT2A с участием генов, вовлеченных в лейкемогенез и регуляцию клеточных функций (RUNX1, DDX10, USP32, USP6, ZNF232, PTGER2 и ARRB1).

Влияние на стратификацию риска

Ретроспективный анализ показал, что среди 26 пациентов, у которых ПГС выявил химерный ген, ранее не детектированный стандартными методами, 14 (56%) были отнесены к группе высокого риска. У 12 пациентов (48% от всех выявленных случаев) исходная группа риска согласно стандартным критериям была промежуточной. Следовательно, обнаружение химерных генов на ранних этапах терапии в этих случаях потенциально могло повлиять на выбор лечебной тактики. У остальных пациентов (n = 14) выявленные перестройки не влияли на стратификацию, поскольку они уже находились в группе высокого риска на основании других критериев (нормальный кариотип с FLT3-ITD, комплексный кариотип и др.) (таблица 5).

Таблица 5

Изменение стратификации риска пациентов ОМЛ-MRD-2018

Table 5

Changes in the risk stratification of the AML-MRD-2018 patients

Исходная группа риска

Initial risk group

Выявленные маркеры

Identified markers

Группа риска после ПГС

Risk group after WGS

Рестратификация по МОБ^*

MRD-based restratification^*

Рецидив

Relapse

Исход (жив/умер)

Outcome (alive/ deceased)

Промежуточный риск

Intermediate risk

Нормальный кариотип без FLT3-ITD (n = 6)

Normal karyotype without FLT3-ITD (n = 6)

KMT2A::MLLT10 (4)

Высокий риск

High risk

–

3/4

3/1

KMT2A::AFDN (1)

Высокий риск

High risk

–

Да

Yes

Жив

Alive

SQSTM1::NUP214 (1)

Высокий риск

High risk

–

Да

Yes

Умер

Deceased

Отсутствие критериев высокого риска (n = 9)

No high-risk criteria (n = 9)

NUP98::NSD1 (3)

Высокий риск

High risk

2/3

3/0

KMT2A::MLLT10 (1)

Высокий риск

High risk

–

Нет

Умер

Deceased

KMT2A::USP2 (1)

Высокий риск

High risk

–

Нет

Жив

Alive

FUS::ERG (1)

Высокий риск

High risk

–

Нет

Умер

Deceased

Xq13.1::HOXC9 (1)

Промежуточный риск

Intermediate risk

–

Да

Yes

Жив

Alive

MSI2::NOM1 (1)

Промежуточный риск

Intermediate risk

–

Да

Yes

Жив

Alive

ETV6::NOM1 (1)

Промежуточный риск

Intermediate risk

–

Нет

Жив

Alive

Высокий риск

High risk

Нормальный кариотип + FLT3-ITD (n = 5)

Normal karyotype + FLT3-ITD (n = 5)

NUP98::NSD1 (2)

Высокий риск

High risk

1/2

1/1

BCL11B::ARID1B (2)

Высокий риск

High risk

–

Да

Yes

1/1

ERG::HNRNPH1 (1)

Высокий риск

High risk

–

Нет

Жив

Alive

Комплексный кариотип (>3) (n = 5)

Complex karyotype (>3) (n = 5)

HOXA9/HOXA10::8q24.13 (1)

Высокий риск

High risk

–

Нет

Умер

Deceased

DDX3X::MLLT10 (1)

Высокий риск

High risk

–

Нет

Жив

Alive

MED14::HOXA9 (1)

Высокий риск

High risk

–

Да

Yes

Жив

Alive

NPM1::BCAT1 (1)

Высокий риск

High risk

–

Нет

Жив

Alive

BCL11B::ARID1B (1)

Высокий риск

High risk

Нет

Жив

Alive

М7 без t(1;22) (n = 1)

M7 without t(1;22) (n = 1)

NIPBL::HOXB9 (1)

Высокий риск

High risk

Нет

Умер

Deceased

Примечание. МОБ – минимальная остаточная болезнь. ^* – рестратификация по МОБ: изменение группы риска на основании мониторинга МОБ (AME >5%, HAM >0,1%).

Notes. MRD – minimal residual disease. ^* – MRD-based restratification: changes in the patients’ risk group based on the results of MRD monitoring (AME >5%, HAM >0.1%).

Ключевые наблюдения

Криптические перестройки ERG (n = 2), NUP98::NSD1 (n = 5) и KMT2A (n = 7) были выявлены исключительно методом ПГС и не определялись стандартными методами, несмотря на высокий процент перестроенных клеток (медиана – 90%). Рецидивы развились у 4 из 7 пациентов с перестройками KMT2A и у 3 из 5 – с NUP98::NSD1.
Рестратификация по МОБ. У 2 пациентов перевод в группу высокого риска был реализован на этапе мониторинга МОБ, что отражало неблагоприятный молекулярный фон и позволило своевременно изменить терапевтическую тактику.
Исходы. В группе пациентов, реклассифицированных в группу высокого риска (по причинам, не связанным с находками ПГС) летальность составила 24% (4 из 17), тогда как среди пациентов, оставшихся в группе промежуточного риска (n = 3), летальных исходов не зарегистрировано. Все 3 пациента (с Xq13.1::HOXC9, MSI2::NOM1 и ETV6::NOM1) остались в промежуточной группе риска и достигли ремиссии.

Кумулятивный анализ диагностической ценности полногеномного секвенирования

Для оценки потенциальной эффективности ПГС при его гипотетическом применении в диагностическом алгоритме проведен ретроспективный анализ кумулятивной частоты выявления новой генетической информации (рисунок 2). На графике представлены 3 кумулятивные кривые, отражающие динамику накопления выявленных маркеров по мере включения пациентов в анализ:

накопление случаев всех выявленных химерных генов в когорте (n = 268; 80%);
накопление случаев, в которых ПГС предоставил новую генетическую информацию, недоступную стандартным методам (полная молекулярная структура, криптические варианты) (n = 40; 12%);
накопление случаев, в которых новая генетическая информация привела бы к изменению стратификации риска (выявление криптических вариантов у пациентов с исходно промежуточным риском; n = 12; 3,6%).

Рисунок 2

Кумулятивная частота выявления химерных генов методом ПГС у пациентов по протоколу ОМЛ-MRD-2018

Кумулятивные кривые демонстрируют динамику накопления выявленных маркеров по мере включения пациентов в анализ: случаев выявленных химерных генов в когорте (зеленая кривая), случаев с новой генетической информацией (синяя кривая) и случаев с изменением стратификации риска (красная кривая)

Figure 2

The cumulative frequency of fusion gene detection by WGS in the patients treated under the AML-MRD-2018 protocol

The cumulative curves illustrate marker accumulation as patients are sequentially included in the analysis: identified fusion genes in the cohort (the green curve), newly discovered genetic information (the blue curve), and changes in risk stratification (the red curve)

Мутационный ландшафт пациентов без химерных генов

У 67 (20%) пациентов, у которых стандартные методы не выявили химерного гена, проведен анализ соматических мутаций методом ПГС. Мутационный профиль характеризовался высокой гетерогенностью и соответствовал известным для ОМЛ паттернам. Выявленные мутации не влияли на стратификацию риска, поскольку их учет уже был предусмотрен протоколом ОМЛ-MRD-2018 (например, FLT3-ITD, биаллельные мутации CEBPA, мутации NPM1).

Спектр мутаций

Анализ соматических мутаций выявил их распределение по нескольким функциональным классам. Наиболее часто мутировавшими являлись гены транскрипционных факторов, на долю которых пришлось 35,8% всех мутаций (n = 24). В эту группу вошли биаллельные (n = 5), моноаллельные (n = 13) мутации CEBPA, мутации GATA1 (n = 5) и единичные наблюдения мутаций GATA2, ETV6, RUNX1.

Нарушения в генах компонентов сигнальных путей составили 34,3% мутаций (n = 23), преимущественно за счет FLT3-ITD/TKD (n = 11), PTPN11 (n = 6), NRAS (n = 3), а также единичных мутаций KRAS, CBL, JAK2.

Гены метаболических ферментов и эпигенетической регуляции выявлены в 22,4% случаев (n = 15), включая мутации NPM1 (n = 7), IDH2 (n = 3), WT1 (n = 2), IDH1 (n = 1) и TET2 (n = 1).

Гены белков репарации ДНК и опухолевые супрессоры составили 14,9% мутаций (n = 10), представленные мутациями NF1 (n = 5), а также единичными наблюдениями BLM, CHEK2, RAD21, STAG2.

Характерные ассоциации

Выявлены следующие закономерности:

трисомия 21 + мутации GATA1 – 4 случая, все с М7-вариантом ОМЛ у детей младше 3 лет;
трисомия 8 + FLT3-ITD – 5 случаев;
биаллельные мутации CEBPA – 5 случаев, все с нормальным кариотипом или изолированными структурными аномалиями;
мутации NPM1 – 7 случаев, все с нормальным кариотипом или изолированными численными аномалиями.

Дополнительные химерные гены, выявленные методом полногеномного секвенирования

У 9 (13,4%) пациентов из этой группы методом ПГС дополнительно выявлены химерные гены. Все события отсутствовали в контрольной выборке здоровых лиц.

Таблица 6

Дополнительные химерные гены, выявленные методом ПГС

Table 6

Additional fusion genes identified by WGS

Пациент Patient	Структурный вариант Structural variant	Вовлеченные гены/регионы Involved genes/regions	Функция вовлеченных генов Function of the involved genes	Предполагаемое действие Proposed effect
№9	PHF6::PHF6	PHF6 (Xq26.3)	Транскрипционный кофактор/репрессор Transcriptional cofactor/repressor	Инактивация гена-супрессора (loss-of-function) Inactivation of a tumor suppressor gene (loss-of-function)
№22	10q23.31::8p12 и/and 8p12::10q23.31	Межгенные регионы Intergenic regions	Межгенные некодирующие регионы Intergenic non-coding regions	Неясно; возможно, нарушение регуляции соседних генов Unclear; possible dysregulation of neighboring genes
№32	del(4)(q34.2q35.1)	4q34.2–q35.1	Регуляторы стресс-ответа и иммунитета (HSP90AA1, TLR3) Regulators of stress response and immunity (HSP90AA1, TLR3)	Потеря генов, вовлеченных в стресс-ответ и иммунитет Loss of genes involved in stress response and immunity
№35	del(8)q22.2	8q22.2	Субъединица транскрипционного комплекса SAGA (SUPT20H) Subunit of the SAGA transcription complex (SUPT20H)	Потеря регулятора транскрипции Loss of a transcriptional regulator
№46	MYO6::XRN1	MYO6 (6q14.1), XRN1 (3q23)	Миозин VI (цитоскелет), экзорибонуклеаза (деградация РНК) Myosin VI (cytoskeleton), exoribonuclease (RNA degradation)	Потенциальное нарушение метаболизма РНК и цитоскелетной организации Potential disruption of RNA metabolism and cytoskeletal organization
№52	del19q13.11, del22q11.21	19q13.11, 22q11.21	Компоненты системы репарации ДНК (ERCC1/2, RAD23A) Components of the DNA repair system (ERCC1/2, RAD23A)	Потеря генов, вовлеченных в репарацию ДНК Loss of genes involved in DNA repair
№56	NFKB1::MEG8 и/and MEG8::NFKB1	NFKB1 (4q24), MEG8 (14q32.31)	Транскрипционный фактор (NF-κB), некодирующая РНК (MEG8) Transcription factor (NF-κB), non-coding RNA (MEG8)	Аберрантная активация NF-κB сигнального пути Aberrant activation of the NF-κB signaling pathway
№60	del(9)(q21q33)	9q21–q33	Корепрессоры транскрипции группы Groucho (TLE1, TLE4) Ranscriptional corepressors of the Groucho family (TLE1, TLE4)	Потеря генов-супрессоров Loss of tumor suppressor genes
№64	NUP188::NUP205 и/and NUP205::NUP188	NUP188 (9q34.11), NUP205 (7q33)	Компоненты ядерной поры (нуклеопорины) Nuclear pore components (nucleoporins)	Нарушение транспорта РНК/белков между ядром и цитоплазмой Disruption of RNA/protein transport between nucleus and cytoplasm

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящем исследовании продемонстрирована высокая диагностическая и клиническая значимость ПГС у детей с ОМЛ, получавших терапию по протоколу ОМЛ-MRD-2018. ПГС показало сопоставимую или более высокую эффективность по сравнению со стандартными методами диагностики, обеспечивая как подтверждение известных генетических нарушений, так и выявление редких и ранее неизвестных перестроек.

Полная конкордантность ПГС с результатами стандартных методов в группе пациентов с известными химерными генами подтверждает высокую чувствительность подхода. Однако ключевое преимущество ПГС заключается в его способности преодолевать ограничения стандартных методов, включая недостаточное разрешение для выявления криптических (скрытых) перестроек и зависимость от заранее выбранных регионов. Выявление ранее не детектированных генетических событий у 8% пациентов с неустановленным драйверным событием в данном исследовании является критически важным показателем. Более чем у половины этих пациентов выявленные перестройки относились к группе неблагоприятного прогноза (перестройки KMT2A и NUP98, FUS::ERG) и могли привести к изменению стратификации риска. Полученные нами данные коррелируют с международными исследованиями, где прирост диагностической значимости методов полногеномного или транскриптомного секвенирования составляет 5–20% [9, 20–22].

Ключевым наблюдением стала идентификация криптических перестроек, включая NUP98::NSD1 и варианты KMT2A, которые не определялись стандартными методами, несмотря на высокий процент опухолевых клеток. Это подтверждает, что выявляемость таких перестроек определяется их структурной организацией, включая инсерционные механизмы (рисунок 3) и особенности локализации генов-партнеров, а не размером опухолевого клона. Полученные результаты согласуются с литературными данными о частом криптическом характере перестроек с участием NUP98 и KMT2A и их ограниченной выявляемости при использовании стандартных цитогенетических подходов [23, 24].

Рисунок 3

Схема инсерционного механизма формирования криптической перестройки KMT2A::MLLT10 у пациента №321

На схеме представлен механизм формирования сложной криптической перестройки, выявленной методом ПГС. На верхней панели показана нормальная структура хромосомы 11 с расположением генов KMT2A (11q23.3) и UBE4A (11q23.3). На средней панели изображен регион, включающий KMT2A и UBE4A, с FISH-зондом на разрыв KMT2A (Kreatech, США; красный сигнал соответствует 3’-концу, зеленый – 5’-концу гена). На нижней панели показано формирование химерных генов KMT2A::MLLT10 и MLLT10::UBE4A в результате инсерции фрагмента хромосомы 11q23.3, содержащего KMT2A и UBE4A, в локус MLLT10 на хромосоме 10. Перестройка также включает делецию в области 11q23.3 с последующим сближением KMT2A и UBE4A. Пунктирными линиями обозначены точки разрыва, стрелками – ориентация генов

Figure 3

A schematic representation of the insertional mechanism underlying the formation of the cryptic KMT2A::MLLT10 rearrangement in patient No. 321

The diagram illustrates the mechanism of the complex cryptic rearrangement detected by WGS. The upper panel shows the normal structure of chromosome 11, with KMT2A and UBE4A located at 11q23.3. The middle panel depicts the genomic region containing KMT2A and UBE4A, along with a KMT2A break-apart FISH probe (Kreatech, USA; the red signal corresponds to the 3′ end and the green signal to the 5′ end of the gene). The lower panel illustrates the formation of the KMT2A::MLLT10 and MLLT10::UBE4A fusion genes resulting from the insertion of a chromosome 11q23.3 fragment containing KMT2A and UBE4A into the MLLT10 locus on chromosome 10. The rearrangement also involves a deletion in the 11q23.3 region, resulting in the juxtaposition of KMT2A and UBE4A. The dotted lines indicate breakpoints, and arrows indicate gene orientation

Дополнительным преимуществом ПГС является возможность детальной характеристики структурной сложности геномных перестроек. В нашем исследовании наибольшее разнообразие сложных вариантов отмечено в группе KMT2A::MLLT10, где число вовлеченных геномных локусов варьировало от 3 до 17. Выявление вторичных химерных генов с участием ключевых драйверов (RUNX1, DDX10) преимущественно в группе KMT2A указывает на более высокий уровень геномной нестабильности. Эти наблюдения согласуются с современными представлениями о том, что перестройки с участием KMT2A часто характеризуются сложной архитектурой с формированием множественных разрывов и вторичных слияний, включая инсерционные и многоэтапные события [24–26]. В противоположность этому классические перестройки факторов связывания ядра (RUNX1::RUNX1T1 и CBFB::MYH11) в нашем исследовании, как и в опубликованных данных, характеризовались относительной геномной стабильностью и низкой частотой дополнительных структурных событий [5, 27].

Хотя клиническое значение вторичных химерных генов в настоящее время остается не до конца определенным, их выявление расширяет представления о молекулярной гетерогенности ОМЛ и подчеркивает преимущества ПГС в детальной характеристике архитектуры геномных нарушений, недоступной при использовании стандартных методов.

Полученные результаты также демонстрируют возможность интеграции данных ПГС в существующие системы стратификации риска. В нашем исследовании выявление дополнительных перестроек привело к потенциальной реклассификации у 3,6% пациентов, преимущественно за счет идентификации криптических вариантов KMT2A и NUP98. Высокая частота рецидивов в этих подгруппах подтверждает их неблагоприятное прогностическое значение и подчеркивает клиническую важность их своевременного выявления [28–30].

Анализ соматических мутаций у пациентов без химерных генов подтвердил известную гетерогенность ОМЛ и выявил характерные ассоциации между цитогенетическими и молекулярными событиями (трисомия 21 с GATA1, трисомия 8 с FLT3-ITD, мутации NPM1 и биаллельные мутации CEBPA) [5, 31, 32]. Однако в отличие от структурных перестроек данные мутации не приводили к реклассификации пациентов. Это объясняется тем, что современные протоколы, включая ОМЛ-MRD-2018, уже интегрировали ключевые молекулярные маркеры в алгоритмы стратификации. Таким образом, основная клиническая добавочная ценность ПГС в данной когорте связана именно с выявлением ранее не диагностированных химерных генов.

Несмотря на сохраняющуюся роль стандартных методов для быстрой диагностики отдельных генетических событий, ПГС обеспечивает комплексную непредвзятую оценку генома в рамках одного анализа, что создает предпосылки для перехода к более унифицированным диагностическим стратегиям [22, 33, 34].

Ограничениями исследования являются его ретроспективный характер и отсутствие проспективной оценки влияния ПГС на клинические исходы. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения клинической эффективности и экономической целесообразности внедрения данного подхода.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом внедрение ПГС в диагностические алгоритмы детского ОМЛ позволяет повысить точность стратификации риска и расширить возможности персонализированного подхода к терапии, особенно у пациентов без выявленных маркеров при использовании стандартных методов.

ВКЛАД АВТОРОВ

К.Р. Ильясова: определение концепции, работа с данными, анализ данных, проведение исследования, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи;

Р.Х. Абасов, Е.В. Матвеев, А.М. Попов, С.А. Плясунова, М.Х. Гуржиханова, Д.А. Венев, И.И. Калинина, Г.А. Новичкова, А.А. Масчан: пересмотр и редактирование рукописи;

А.Б. Итов, А.Н. Казакова, В.А. Козеев: проведение исследования, пересмотр и редактирование рукописи;

М.А. Масчан, Е.А. Зеркаленкова: руководство исследованием, валидация, пересмотр и редактирование рукописи.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

K.R. Iliasova: conceptualization, data curation, formal analysis, investigation, writing – original draft, writing – review & editing;

R.Kh. Abasov, E.V. Matveev, A.M. Popov, S.A. Plyasunova, M.Kh. Gurzhikhanova, D.A. Venyov, I.I. Kalinina, G.A. Novichkova, A.A. Maschan: writing – review & editing;

A.B. Itov, A.N. Kazakova, V.A. Kozeev: investigation, writing – review & editing;

M.A. Maschan, E.A. Zerkalenkova: supervision, validation, writing – review & editing.

ЭТИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА

Данное ретроспективное исследование было одобрено этическим комитетом НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева (протокол №11/2018 от 20.11.2018) и проводилось в соответствии с положениями Хельсинкской декларации. Все пациенты и/или законные представители пациентов дали информированное согласие на использование биологического материала.

ETHICS REVIEW

This retrospective study was approved by the Ethics Committee of the D. Rogachev NMRCPHOI (Protocol No.11/2018 dated 20.11.2018) and was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki. All the patients and/or their legal representatives signed informed consent to the use of biological material.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Данное исследование не имело финансовой поддержки от сторонних организаций.

FUNDING

No funding was received for this study.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.