Verification of the method for measuring erythrocyte filterability using the IDA-01 device

Full Text

Анемия – состояние, при котором снижается кислородная емкость крови из-за уменьшения концентрации гемоглобина и/или количества эритроцитов, что может вызывать гипоксию и гипоксемию. Один из основных механизмов развития анемии – гемолиз – связан с ускоренным разрушением и, следовательно, сокращением продолжительности жизни эритроцитов в кровотоке.

Наследственные гемолитические анемии (НГА) могут иметь различные причины, связанные с аномалиями ферментов метаболизма эритроцитов, эритроцитарных мембран или нарушением структуры и синтеза гемоглобина [1–4]. Эти причины разнообразны, но клинические признаки гемолитических анемий часто очень похожи, что затрудняет их дифференциальную диагностику. Как правило, к клиническим признакам НГА относятся гемолиз, уменьшение количества эритроцитов, снижение концентрации гемоглобина в крови (до <110 г/л), желтуха, увеличение количества ретикулоцитов, спленомегалия, развитие желчнокаменной болезни, повышение концентрации неконъюгированного билирубина в сыворотке и снижение концентрации гаптоглобина, лактата и пирувата [5].

Для выполнения своей физиологической функции (транспорта газов) эритроциты должны длительное время циркулировать в кровотоке, достигая всех тканей, что включает многократное прохождение через узкие капилляры и селезеночные синусы, диаметр которых в 2–3 раза меньше диаметра эритроцитов. Это обеспечивается уникальной гибкостью и деформируемостью эритроцитов, которая является функцией структуры белков цитоскелета и зависит от поддержания объема эритроцитов и отношения площади поверхности мембраны к объему клетки. Неспособность к деформации приводит к сокращению продолжительности жизни эритроцитов из-за их разрушения и, следовательно, к гемолизу [6, 7]. Таким образом, измерение деформируемости эритроцитов может быть хорошим диагностическим признаком возможной анемии.

Снижение деформируемости эритроцитов сильнее влияет на микрореологию крови, чем на ее макрореологию, поскольку в узких капиллярах силы, действующие на эритроциты (сдвиговое напряжение), могут быть в 10–100 раз больше, чем те, которые действуют на них в крупных сосудах [8]. В настоящее время для определения деформируемости эритроцитов используются различные методы. Подробное описание этих методов можно найти в опубликованных обзорах [6, 9–12]. Однако почти все эти методы не подходят для рутинной диагностики способности эритроцитов проходить через узкие капилляры. Некоторые из них измеряют деформацию эритроцитов (их отклонение от дисковидной формы) при протекании клеточной суспензии в среде высокой плотности через канал, диаметр которого превышает диаметр эритроцита. Такой подход позволяет определить только средние параметры деформируемости во всей популяции эритроцитов, но не способен выявить небольшую долю клеток (~0,1–1,0% их общего числа) с пониженной деформируемостью, которые могут серьезно влиять на микрореологию крови в организме. К таким методам относятся эктацитометрия в различных вариантах (с осмотическим или кислородным градиентом) [13–16] или цитометрия деформируемости в реальном времени [17], когда анализируются изображения эритроцитов, проходящих через камеру проточного цитометра, полученные под микроскопом с помощью высокоскоростной видеокамеры. Другие методы (аспирация эритроцитов в микрокапилляр [18], атомно-силовая микроскопия [19, 20], оптический пинцет [21–23] и др.) не подходят для рутинной диагностики, поскольку они работают с отдельными клетками, и, следовательно, для надежной идентификации небольшой доли плохо деформируемых клеток с помощью таких методов необходимо обработать не менее 50 тыс. отдельных клеток, что очень трудоемко и занимает много времени.

Еще одна группа методов для оценки способности эритроцитов деформироваться – фильтрационные методы, которые измеряют скорость прохождения эритроцитов через искусственные фильтры с порами, диаметр которых несколько меньше, чем диаметр эритроцитов [24–26]. В описанных ранее вариантах этих методов фильтруемость измеряли либо как время протекания через фильтр определенного объема цельной крови или суспензии эритроцитов, либо как отношение давление–поток. При этом фильтрация клеток через поры проходит под действием гравитации или путем приложения положительного или отрицательного давления. В таких постановках метод измерения фильтруемости эритроцитов имеет плохую воспроизводимость. Это связано с тем, что если для фильтрования использовали цельную кровь, то часть пор может блокироваться плохо фильтрующимися бóльшими по размеру лейкоцитами или микроагрегатами тромбоцитов. Если же фильтруемость эритроцитов характеризовали только временем прохождения через фильтр определенного объема суспензии отмытых эритроцитов, то, так как фильтры даже внутри одной серии всегда недостаточно однородны и имеют вариации в размере и числе пор, измеряемое время фильтрации образца при прохождении через разные фильтры сильно варьирует даже для одной и той же суспензии [24–26].

Появившиеся не так давно методы микрофлюидики [27–29] измеряют скорость прохождения суспензии эритроцитов не через фильтры, а через микрофлюидные чипы с каналами различной толщины и геометрии, имитирующими структуру капилляров и межэндотелиальных щелей в селезенке (при контролируемом давлении). Процесс деформации фиксируется с помощью высокоскоростной видеомикроскопии. Эти методы претендуют на то, что измеряют ток эритроцитарной суспензии в условиях, максимально приближенных к реально существующим in vivo. Однако их применение сильно ограничено необходимостью специального дорогостоящего оборудования, сложностью изготовления и высокой стоимостью микрофлюидных чипов, а главное – сложностью стандартизации условий эксперимента, что препятствует сравнению результатов, полученных как в одной, так и в разных лабораториях. Таким образом, для улучшения диагностики причин гемолитических анемий необходимо иметь стандартизованный метод и соответствующую установку, позволяющие определять способность эритроцитов деформироваться и проходить через узкие капилляры, так как именно эта способность определяет микрореологию крови.

Наиболее подходящим методом для характеристики способности эритроцитов проходить через узкие капилляры могло бы быть измерение фильтруемости эритроцитов через искусственные мембранные фильтры с диаметром пор от 3 до 5 мкм. Однако этот метод никогда не использовался для диагностики НГА, поскольку, как было сказано выше, его описанные в литературе варианты имеют плохую воспроизводимость. Недавно мы впервые предложили использовать модифицированный метод измерения фильтруемости эритроцитов для дифференциальной диагностики наследственного сфероцитоза (НС) на фоне других НГА (дефицита пируваткиназы (ДПК) и наследственного стоматоцитоза (НСт)) [30].

Механизмы, лежащие в основе этих состояний, различаются. В то время как при ДПК нарушаются метаболизм эритроцитов и энергетический баланс из-за снижения активности гликолитического фермента пируваткиназы, при НС, НСт и других НГА, связанных с нарушениями строения мембран, анемия вызывается генетическими мутациями, приводящими к качественному или количественному дефициту определенных мембранных белков (рисунок 1).

 

Рисунок 1

Схематическое представление белков (отдельных белков – ионных каналов (PIEZO1 и KCNN4) и комплексов белков цитоскелета мембраны эритроцитов), ответственных за развитие различных мембранопатий эритроцитов [31]

GPA – гликофорин A; GPC – гликофорин C; Band3 – белок полосы 3; Rh – белок резус-фактора; RhAG – гликопротеин, ассоциированный с резус-фактором; Stomatin – стоматин; 4.1 – белок 4.1R; GLUT1 – транспортер глюкозы; Actin – актин; Ankyrin – анкирин; 4.2 – белок 4.2; CD47 – клеточные детерминанты 47; a-spectrin – a-спектрин; b-spectrin – b-спектрин; p.55 – белок 55; Tropomodulin – тропомодулин; PIEZO1 – механочувствительный канал, образующий пору в мембране, через которую могут транспортироваться ионы, аденозинтрифосфат, другие малые молекулы и вода; KCNN4 – активируемый ионами Ca²⁺ калиевый канал (канал Гардоса). Пунктирные рамки обозначают белковые комплексы, нарушения в которых вызывают определенные типы заболеваний (НС, наследственный эллиптоцитоз и пиропойкилоцитоз или дегидратированный НСт)

Figure 1

A schematic representation of proteins (individual proteins (ion channels PIEZO1 and KCNN4) and protein complexes of red cell membrane cytoskeleton), responsible for the development of different red blood cell membranopathies [31]

GPA – glycophorin A; GPC – glycophorin C; Band3 – the band 3 protein; Rh – the rhesus factor protein; RhAG – rhesus-associated glycoprotein; 4.1 – the 4.1R protein; GLUT1 – glucose transporter; 4.2 – the 4.2 protein; CD47 – cell determinants 47; р.55 – the protein 55; PIEZO1 – a mechanosensitive channel forming a pore in the membrane, through which ions, adenosine triphosphate, other small molecules and water can be transported; KCNN4 – Ca²⁺ activated potassium channel (the Gárdos channel). Dashed frames represent protein complexes, whose defects underlie certain types of diseases (hereditary spherocytosis, hereditary elliptocytosis and pyropoikilocytosis or dehydrated hereditary stomatocytosis)

 

При НС нарушаются взаимодействия между белками, которые связываются с цитоскелетом внутренней мембраны эритроцита и его наружным липидным бислоем (белки комплексов, определяющих вертикальные взаимодействия в мембране) [2]. НСт вызывается нарушением гидратации эритроцитов. Это гетерогенная группа заболеваний, связанных с нарушениями водно-солевого баланса эритроцитов из-за изменений проницаемости мембраны для ионов калия и натрия, что приводит к изменениям объема эритроцитов [32–34]. Любые аномалии мембраны сопровождаются снижением способности эритроцитов деформироваться при прохождении через микрокапилляры. Для диагностики НГА мы предложили модифицированный метод измерения фильтруемости эритроцитов. Для этого был использован ранее разработанный и запатентованный прибор ИДА-01 [30, 35–37] (рисунок 2).

 

Рисунок 2

Схема прибора для измерения фильтруемости эритроцитов ИДА-01

1 – колонка; 2 – держатель колонки; 3 – ячейка для образца; 4 – измерительный зонд; 5 – блок регистрации времени протекания образца через фильтр; 6 – провод высокой гибкости алюминиевый 3-жильный; 7 – провод высокой гибкости алюминиевый 2-жильный с адаптером для подключения к блоку питания; 8 – фильтр полиэтилентерефталатный; 9 – затвор

Figure 2

A scheme of the device for measuring erythrocyte filterability (the IDA-01)

1 – a column; 2 – a column holder; 3 – a sample well; 4 – a measuring probe; 5 – a block for registering time of flow of the sample through the filter; 6 – a 3-core highly flexible aluminum wire; 7 – a 2-core highly flexible aluminum wire with power adapter; 8 – polyethylene terephthalate filter; 9 – a stopcock

 

Чувствительность предлагаемого метода была увеличена за счет использования суспензии отмытых эритроцитов вместо цельной крови и уменьшения разброса результатов, возникающего из-за недостатков используемых фильтров. Для этого мы определяли фильтруемость каждой суспензии как отношение времени, за которое буфер проходит через фильтр, ко времени, за которое такое же количество суспензии эритроцитов проходит через тот же фильтр. Эта нормировка снимает ограничения, связанные с различием в свойствах пор фильтра, которые вносят основной вклад в невоспроизводимость. В таком варианте метод дает возможность почувствовать присутствие в суспензии даже малой фракции плохо фильтрующихся клеток.

Полученные в работе Д.С. Прудинника и соавт. [30] результаты показали, что по сравнению с фильтруемостью эритроцитов здоровых доноров наиболее значительно фильтруемость снижается при сфероцитозе, менее значительно – при HСт и очень мало изменяется при ДПК.

Таким образом, тест фильтруемости эритроцитов оказался достаточно чувствительным и специфичным при диагностике HС и не уступал в этом отношении ЭMA-тесту, который на сегодняшний день считается лучшим для такой диагностики [30]. Однако аналитическая эффективность (точность, чувствительность, специфичность) использованного для измерения фильтруемости эритроцитов прибора ИДА-01 до сих пор не была исследована подробно. Этому посвящена настоящая работа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Доноры

Для характеристики аналитической эффективности прибора ИДА-01 и определения референсного интервала нормальных значений фильтруемости эритроцитов в работе были использованы выделенные из периферической венозной крови и отмытые стандартным способом эритроциты доноров (n = 46) (медиана и область возраста – 36 (17–75) лет, мужчин было 34, женщин – 12). Для определения биологической чувствительности метода, т. е. доли измененных клеток, которую прибор способен достоверно отличить от клеток здоровых доноров, был создан ряд образцов, в которых при одинаковом общем гематокрите (Ht) 1% присутствовала разная доля клеток с плохой фильтруемостью (от 0,003% до 0,03%). В качестве клеток с плохой фильтруемостью были использованы эритроциты того же донора, обработанные 0,08% раствором глутарового альдегида.

Забор крови и пробоподготовка

Кровь доноров забирали в вакуумную пробирку объемом 3 мл (S-monovette, Sarstedt, Германия) с 3,2% (0,106M) цитратом натрия или в вакуумную пробирку объемом 2,6 мл (S-monovette, Sarstedt, Германия) с K₃ЭДTA в качестве антикоагулянта. Оба антикоагулянта для измерения фильтруемости эритроцитов равнозначны. Для выделения эритроцитов кровь была центрифугирована при 1000g в течение 8 мин. Верхний слой плазмы вместе с лейкотромбослоем был удален, и далее эритроциты отмывались центрифугированием при 1000g в течение 8 мин 2 раза 4-кратным объемом сначала забуференного фосфатом солевого раствора (PBS) (2,7 мМ KCl, 137 мМ NaCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 1,76 мМ КН₂РО₄, рН 7,4), приготовленного путем растворения 1 таблетки коммерческого препарата PBS (Sigma-Aldrich. США) в 200 мл дистиллированной воды, а затем заранее приготовленного буфера Тироде (135 мM NaCl, 4 мM KCl, 0,33 мM NaH₂PO₄, 1 мM MgCl₂, 11 мM глюкозы, 2,5 мM CaCl₂, 10 мM HEPES и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, pH 7,4). Отмытые эритроциты были последовательно ресуспендированы в растворе Тироде до Ht 1% и использованы для измерения фильтруемости.

Приготовление эритроцитов, обработанных глутаровым альдегидом

Для приготовления эритроцитов со сниженной деформируемостью из отмытых 2 раза раствором PBS эритроцитов готовили суспензию с Ht 40%. К 300 мкл этой суспнзии добавляли 300 мкл раствора глутарового альдегида (0,16%) и инкубировали смесь в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем к 500 мкл этой смеси добавляли 9500 мкл буфера GASP (9 мM Na₂HPO₄, 1,3 мM NaH₂PO₄, 140 мM NaCl, 5,5 мM глюкозы, 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, pH 7,4, 290 мОсм), перемешивали и центрифугировали при 1000g в течение 8 мин. Снимали надосадок и добавляли 9500 мкл буфера Тироде. В результате получали суспензию обработанных глутаровым альдегидом эритроцитов с Ht 1%.

Измерение фильтруемости эритроцитов

Для проведения измерения колонку прибора ИДА-01 (рисунок 2) заполняли буфером (Тироде, 1,4 мл), сверху накладывали полиэтилентерефталатный фильтр производства Объединенного института ядерных исследований (Дубна, Московская область) (диаметр фильтра – 16 мм², диаметр цилиндрических пор – 3,5 мкм, толщина фильтра – 10 мкм), затем на колонку сверху навинчивали ячейку для образца, в которую вносили 570 мкл буфера Тироде, закрывали измерительным зондом (крышкой, в которую вмонтировано 3 игольчатых электрода) и открывали затвор внизу колонки, позволяя буферу протекать через фильтр и вытекать из установки. Блок электронной регистрации времени протекания образца через фильтр включается автоматически, когда в ячейку для образца вводят измерительный зонд и открывают затвор. Фиксировали время протекания 250 мкл буфера через фильтр (tb). Нижний затвор прибора закрывали после того, как из верхнего отсека вытечет весь буфер. Не меняя фильтр, помещали в ячейку для образца 570 мкл суспензии исследуемых эритроцитов (Ht 1%). Вводили в ячейку для образца измерительный зонд. Открывали нижний затвор и фиксировали время протекания 250 мкл суспензии через фильтр (ts). Рассчитывали показатель фильтруемости:

F = tb / ts.

Статистическая обработка данных

Всю статистическую обработку проводили в программе OriginPro 8.1 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, США).

Нормальность распределения величин фильтруемости эритроцитов доноров была доказана методом Шапиро–Вилка, поэтому далее результаты были обработаны с использованием критерия Стьюдента.

При определении референсного интервала нормальных значений фильтруемости эритроцитов были оценены среднее арифметическое значение фильтруемости (F_ср) и стандартное отклонение (±SD).

Достоверность различий относительных ошибок в двух независимых сериях экспериментов, проведенных в разных лабораториях для измерения воспроизводимости результатов, была оценена с помощью теста Фишера. Учитывая, что ошибки в двух сериях не различались достоверно, то есть что дисперсии были однородны, сравнение средних величин фильтруемости, полученных в каждой из серий экспериментов, было проведено согласно модифицированному тесту Стьюдента [38].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Аналитическая эффективность прибора для определения фильтруемости эритроцитов определяется его аналитической чувствительностью и специфичностью.

Параметры, определяющие аналитическую чувствительность

Точность определения времени фильтрации, которую позволяет прибор

В существующем варианте прибора ИДА-01 время измеряется с точностью до ±0,1 с. Измерение может происходить непрерывно от 0 до 999,9 с (16,67 мин), после этого прибор быстро обнуляется, и, если необходимо, измерение может быть сразу продолжено. Однако практически такие времена измерять не требуется.

Сходимость (повторяемость) результатов

Для изучения повторяемости результатов измерений одним и тем же оператором в один и тот же день на одном и том же приборе было измерено 10 раз время протекания через один и тот же фильтр 250 мкл буфера Тироде, который используется при определении фильтрации эритроцитов с помощью предлагаемого прибора (tb). Из полученных результатов были рассчитаны: средняя величина (tb_ср, с); SD (с); относительная ошибка каждого измерения, равная |tb_i – tb_ср| × 100 / tb_ср (%), и средняя относительная ошибка измерений, а также коэффициент вариации, определенный как величина SD относительно средней величины (%) (таблица).

 

Таблица

Повторяемость результатов измерения времени протекания через фильтр 250 мкл буферного раствора Тироде

Table

Repeatability of measurements of the filtration time of 250 μL Tyrode buffer solution

Повторное измерение Repeated measurement	tbi, с tbi, s	Повторное измерение Repeated measurement	tbi, с tbi, s	Среднее значение tbi, с Mean tbi, s	SD, с SD, s	Средняя относительная ошибка, % Mean relative error, %	Коэффициент вариации, % Coefficient of variation, %
№1	1,7	№6	1,7	1,72	0,06	2,79	3,5
№2	1,7	№7	1,6
№3	1,8	№8	1,7
№4	1,8	№9	1,7
№5	1,8	№10	1,7

 

Поскольку при оценке качества измерительной системы принято считать хорошей величину коэффициента вариации <10% и величину относительной ошибки <5%, можно считать, что повторяемость результатов при измерении прибором ИДА-01 времени протекания через фильтр буфера Тироде оказалась очень хорошей.

Предел обнаружения

Предел обнаружения (limit of detection) определяет, какую величину сигнала прибор может надежно отличить от фона (в нашем случае от времени протекания через фильтр буфера без клеток). По определению принято считать эту величину равной 3,3 × SD фона, так как при этом 99,9% случайных отклонений при измерении фона будут отсечены. В нашем приборе при 10-кратном повторении пропускания буфера через один и тот же фильтр величина SD составила 0,06 с, а предел обнаружения – 3,3 × 0,06 = 0,198 с, или ~0,2 с.

Воспроизводимость результатов измерения

Воспроизводимость результатов показывает, насколько хорошо результаты совпадают, если они получены в разных лабораториях, разными операторами, в разные дни. Для определения воспроизводимости результатов было проведено измерение фильтруемости эритроцитов доноров в двух сериях экспериментов:

1. в Городской клинической больнице №40 Департамента здравоохранения г. Москвы (n = 15);
2. в лаборатории биофизики ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России (n = 31).

Внутри каждой серии измерения также были проведены в разные дни. Статистическая обработка результатов была проведена согласно работе А.В. Гармаш и Н.М. Сорокина [38].

Нормальность распределения значений фильтруемости эритроцитов в каждой серии экспериментов была проверена и доказана тестом Шапиро–Вилка, поэтому далее результаты были обработаны с использованием критерия Стьюдента.

Отдельная статистическая обработка результатов каждой серии измерения фильтруемости эритроцитов доноров показала следующее:

1. ГКБ №40: средняя фильтруемость F_ср1 = 0,8437; SD₁ = 0,0352; n₁ = 15; f₁ = 14;
2. лаборатория биофизики: F_ср2 = 0,8371; SD₂ = 0,0305; n₂ = 31; f₂ = 30,

где F_ср1 и F_ср2 – средние значения фильтруемости в каждой серии измерений; SD₁ и SD₂ – соответствующие стандартные отклонения, n₁ и n₂ – число измерений в каждой серии; а f₁ и f₂ – число соответствующих степеней свободы в каждой серии измерений.

Сравнение воспроизводимости результатов в обеих сериях измерений было проведено с помощью теста Фишера.

Согласно этому критерию воспроизводимости не различаются значимо в том случае, если показатель ξ = SD₁² / SD₂² не превышает коэффициент Фишера, рассчитанный для выбранного уровня значимости (р) и соответствующих степеней свободы для каждой из серий проведенных измерений (f) (коэффициент Фишера берется из таблиц).

В нашем случае:

ξ = SD₁² / SD₂² = 1,2 × 10^–3 / 9,3 × 10^–4 = 1,29 < 2,74 (коэффициент Фишера при p = 0,99, f₁ = 14, f₂ = 30).

Таким образом, воспроизводимость в обеих сериях экспериментов достоверно не различается (дисперсии однородны).

После этого было исследовано, существуют ли достоверные различия между средними величинами фильтруемости, полученными в обеих сериях. Поскольку дисперсии однородны, для этого можно применить модифицированный тест Стьюдента. Условием отсутствия достоверных различий средних значений двух серий измерений в этом тесте является:

ξ1 = |F_ср1–F_ср2| × [n₁ × n₂ / (n₁ + n₂)]^1/2 / SD_ср < t

(p = 0,99, f = n₁ + n₂ – 2 = 44),

где t –соответствующий коэффициент Стьюдента для определенного уровня значимости и числа степеней свободы f.

В нашем случае t = 2,69 (из таблиц коэффициентов Стьюдента).

SD_ср = [(f₁ × SD₁² + f₂ × SD₂²) / (f₁ + f₂)]^1/2 = 0,0321.

Таким образом:

ξ₁ = [(0,8437–0,8371) × (15 × 31 / 46)^1/2] / SD_ср = 0,0066 × 3,1794 / 0,0321 = 0,6537.

Очевидно, что средние значения в обеих сериях измерений достоверно не различаются даже при р = 0,99, так как ξ₁ < t. Обе серии измерений можно анализировать совместно.

Отличное совпадение полученных в разных лабораториях средних величин говорит о том, что метод не имеет смещения из-за систематической ошибки.

В результате получаем, что средняя фильтруемость эритроцитов доноров ± SD равна 0,84 ± 0,03 (n = 46, коэффициент вариации – 3,57%).

Далее в качестве референсного интервала нормальных значений используем значения среднего ± 1 SD (т. е. от 0,81 до 0,87).

Величины фильтруемости эритроцитов, а также относительные ошибки в их определении, полученные в каждой серии измерений, приведены на рисунке 3.

 

Рисунок 3

Распределение результатов измерения фильтруемости эритроцитов доноров (А) и относительных ошибок (Б) в двух сериях измерений, проведенных в разных лабораториях

Размер боксов соответствует области от 25-го до 75-го процентиля всех измеренных величин. Медианы показаны горизонтальными линиями, длина «усов» соответствует 1 SD, приведены средние арифметические значения (обозначены квадратами)

Figure 3

The distribution of measurements of red blood cell filterability in the donors (A) and of relative errors (Б) in two series of experiments performed at different laboratories

Boxes extend from the 25^th to the 75^th percentile of all the measured values. The medians are shown as horizontal lines, the whiskers represent 1 SD, and the squares represent mean values

 

Общее распределение всех измеренных в двух сериях величин фильтруемости эритроцитов здоровых доноров приведено на рисунке 4.

 

Рисунок 4

Распределение значений фильтруемости эритроцитов в группе доноров (n = 46)

Данные результаты были использованы для определения референсного интервала нормальных значений фильтруемости эритроцитов, который был определен как величина среднего значения этого показателя в группе доноров ± 1 SD (так как согласно тесту Шапиро–Вилка эти значения следуют нормальному распределению). Полученный референсный интервал составил 0,81–0,87. Размер бокса соответствует области, включающей от 25-го до 75-го процентилей всех полученных значений. Горизонтальная линия представляет медиану всех значений (0,84), которая совпадает с их средним арифметическим, обозначенным квадратом. Длина усов соответствует величине 1 SD

Figure 4

The distribution of red blood cell filterability values in the donor group (n = 46)

These results were used to establish the normal reference range of erythrocyte filterability which was determined as a mean value in the donor group ± 1 SD (because according to the Shapiro-Wilk test, these values follow the normal distribution). The determined reference range was 0.81–0.87. The box extends from the 25^th to the 75^th percentile of all the measured values. The horizontal line represents the median of all the values (0.84), which coincides with the mean value (shown as a square). The whiskers represent 1 SD

 

Предел обнаружения патологически измененных клеток (определение биологической чувствительности прибора)

Чтобы определить биологическую чувствительность, т. е. минимальное число клеток с плохой фильтруемостью, которую прибор может установить достоверно, был поставлен эксперимент, в котором была приготовлена серия суспензий клеток одного донора, в которой при постоянном общем Ht суспензии 1% количество плохо деформируемых клеток в пробах было различным. В качестве них были использованы клетки того же донора, обработанные 0,08% раствором глутарового альдегида. Эксперимент показал, что фильтрация суспензии снижалась линейно при повышении процента плохо деформируемых клеток в образце (рисунок 5).

 

Рисунок 5

Зависимость величины фильтруемости суспензии эритроцитов от содержания в ней нефильтрующихся (обработанных 0,08% глутаровым альдегидом) клеток

Интервал, соответствующий F_ср ± 3,3 × SD, был рассчитан как из измеренного среднего значения и SD_ср фильтруемости эритроцитов донора (n = 5), так и из полученной линейной аппроксимации. При этом получилось, что в обоих случаях уже первое значение фильтруемости при концентрации плохих клеток 0,003% достоверно отличается от фильтруемости хорошо деформируемых клеток

Figure 5

The dependence of filterability of RBC suspension on the percentage of non-filterable cells (exposed to 0.08% glutaraldehyde)

The interval corresponding to F_mean ± 3.3 × SD was calculated both from the measured mean and SD_mean of donor erythrocyte filterability values (n = 5) and from the linear approximation. In both cases, the first filterability value at a concentration of 0.003% of poorly deformable cells was already significantly different from the filterability of normal cells

 

Чтобы определить минимальную концентрацию плохо деформируемых клеток, которую можно отличить от хорошо деформируемых достоверно (т. е. определить биологическую чувствительность прибора), фильтруемость исходных клеток была принята за фон, а предел обнаружения был рассчитан как 3,3 × SD хорошо деформируемых клеток. Средняя величина фильтруемости исходных клеток донора (хорошо деформируемых) и соответствующая их величина SD в проведенной серии экспериментов были определены из повторных измерений (n = 5). Область, соответствующая F_ср хорошо деформируемых клеток ± 3,3 × SD хорошо деформируемых клеток была равна 0,82 ± 0,05 (т. е. 0,77–0,87). Значения фильтруемости, выходящие за пределы этого интервала, отличаются от фильтруемости хорошо деформируемых клеток достоверно.

Из представленного графика видно, что прибор достоверно определяет присутствие в суспензии 0,003% нефильтрующихся клеток, причем измеряемая зависимость линейна, по крайней мере, до концентрации нефильтрующихся клеток 0,03%. При этом величина исходной фильтруемости падает более чем в 9 раз.

Специфичность прибора для измерения фильтруемости эритроцитов

В принципе прибор может измерять время протекания через фильтр суспензии любых частиц, которые способны проходить через поры диаметром 3–5 мкм. Специфичность прибора определяется его способностью измерять именно тот показатель, для которого прибор предназначен, исключая влияние посторонних факторов.

При измерении фильтруемости эритроцитов с помощью прибора ИДА-01 определяется время протекания через фильтр либо стандартного буфера (Тироде), либо 1% суспензии отмытых стандартным способом эритроцитов в том же буфере. Проверено, что время протекания буфера практически не изменяется при возможных незначительных ошибках (от 1 до 3%) в концентрациях его компонентов. Время протекания суспензии эритроцитов может зависеть только от свойств самих эритроцитов (которые измеряются), поскольку проба всегда содержит только стандартно отмытые эритроциты в стандартном буфере и не содержит никаких возможных примесей из образца крови пациента, которые могли бы повлиять на результат измерения (лекарственные соединения, другие клетки крови и белки плазмы). Таким образом, состав образца всегда постоянен и не содержит никаких возможных интерферентов.

Правильность получаемого результата может зависеть только от корректности пробоподготовки, а именно от полноты освобождения пробы крови от лейкоцитов, имеющих больший, чем у эритроцитов, клеточный диаметр, и от точности величины Ht приготовленной для анализа суспензии отмытых эритроцитов.

Если среднее содержание эритроцитов в крови составляет примерно 4 × 10¹² клеток/л крови (при Ht примерно 40%), то в отцентрифугированной крови (до Ht примерно 80%) их количество составляет 8 × 10¹² клеток/л суспензии или 8 × 10⁹ клеток/мл суспензии или 2 × 10⁹ клеток/250 мкл 80% суспензии. После разбавления до Ht 1% количество эритроцитов в суспензии будет примерно 2,5 × 10⁷ штук/250 мкл. С другой стороны, если средняя концентрация лейкоцитов в крови (при Ht 40%) составляет 10 × 10⁹ клеток/л, то после центрифугирования (до Ht эритроцитов 80%) и при условии, что снятие лейкотромбослоя удаляет примерно 90% лейкоцитов, в образце останется только 10% этих клеток, т. е. 2 × 10⁹ клеток/л суспензии эритроцитов или 2 × 10⁹ / 4 × 10³ = 5 × 10⁵ лейкоцитов/250 мкл суспензии эритроцитов (с Ht 80%). После двукратного промывания суспензии эритроцитов 4-кратными объемами растворов PBS и Тироде и последующего разбавления 80% суспензии эритроцитов до Ht 1%, содержание лейкоцитов в 250 мкл пробы будет составлять 5 × 10⁵ / (4 × 4 × 80), или примерно 391 клетка/250 мкл образца. Таким образом, содержание лейкоцитов в пробе составляет примерно 0,00156% от содержания в ней эритроцитов. Такое количество не может существенно повлиять на измеряемое время фильтрации суспензии.

Измеренная нами точность приготовления суспензии эритроцитов составляет 1,00 ± 0,05% и также не оказывает существенного влияния на получаемый результат.

Поскольку фильтры не совсем однородны, то если способность клеток фильтроваться определяют только временем прохождения их суспензии через фильтр, это приводит к большому разбросу результатов, полученных для одной и той же суспензии на разных фильтрах. Чтобы учесть неоднородность используемых фильтров, а также возможные незначительные изменения в вязкости суспензии в приборе ИДА-01 фильтруемость эритроцитов характеризуется отношением времен протекания буфера и равного объема эритроцитарной суспензии (Ht 1%) в том же буфере через один и тот же фильтр. Это автоматически учитывает разницу в качестве фильтров и вязкости среды и сильно повышает воспроизводимость результатов. Таким образом, можно сказать, что при строгом соблюдении условий пробоподготовки и проведения измерения специфичность самого прибора и метода составляет примерно 100%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты показали, что тест фильтруемости эритроцитов, проводимый с помощью прибора ИДА-01, высокочувствителен и специфичен. Он может составить конкуренцию ЭMA-тесту, который в настоящее время считается «золотым стандартом» при диагностике HС. При этом наличие в редких случаях высоких показателей фильтруемости у пациентов с подозрением на HС является показанием для более тщательного исследования для установления точного диагноза.

Предложенный метод прост, не требует дорогого оборудования и может быть легко выполнен в любой лаборатории. Все это делает данный тест многообещающим для диагностики HС.

ВКЛАД АВТОРОВ

А.С. Суворова, Д.С. Прудинник, Е.А. Бовт: работа с данными, анализ данных, проведение исследования;

Н.С. Кушнир: работа с данными, анализ данных, проведение исследования, написание черновика рукописи;

Ф.И. Атауллаханов : определение концепции, разработка методологии, руководство исследованием;

Е.И. Синауридзе: определение концепции, разработка методологии, визуализация, работа с данными, анализ данных, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи, руководство исследованием.

Окончательный вариант рукописи одобрен всеми авторами.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

A.S. Suvorova, D.S. Prudinnik, E.A. Bovt: data handling and analysis, conduction of the study;

N.S. Kushnir: data handling and analysis, conduction of the study, drafting of the manuscript;

F.I. Ataullakhanov : study conception, development of methodology, study supervision;

E.I. Sinauridze: study conception, development of methodology, visualization, data handling and analysis, drafting of the manuscript, manuscript revision and editing, study supervision.

All the authors approved the final version of the manuscript.

ЭТИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА

Исследование одобрено независимым этическим комитетом и утверждено решением ученого совета ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России (протокол №1/6-2024 от 20.02.2024).

ETHICS REVIEW

The study was approved by the Independent Ethics Committee and the Scientific Council of the Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation (protocol No.1/6-2024 dated 20.02.2024).

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации (Государственное задание ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, регистрационный номер 125031003410-4).

FUNDING

The study was carried out with the support of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (State Assignment for the Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, registration No.125031003410-4).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

CONFLICT OF INTEREST

The authors confirm that there is no conflict of interest to declare.

About the authors

A. S. Suvorova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: sinaurid@list.ru
ORCID iD: 0009-0004-9565-5591
Russian Federation, Moscow

N. S. Kushnir

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: sinaurid@list.ru
ORCID iD: 0009-0003-8800-6465
Russian Federation, Moscow

D. S. Prudinnik

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Email: sinaurid@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-5995-7702
Russian Federation, Moscow; Moscow

E. A. Bovt

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Email: sinaurid@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-4724-8647
Russian Federation, Moscow; Moscow

F. I. Ataullakhanov

Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Email: sinaurid@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-3403-181X
Russian Federation, Moscow

Elena I. Sinauridze

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: sinaurid@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-5948-3444

Doctor of Biological Sciences, Candidate of Chemical Sciences, Head of the Laboratory of Biophysics at the Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Head of the Laboratory of Cell Physiology and Biophysics at the Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files