Pathogen-specific immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation using an αβ T cell depletion platform in children with acute leukemia

Full Text

Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является эффективным и потенциально излечивающим методом терапии пациентов с гематологическими злокачественными заболеваниями высокого риска. Применение платформы αβ-T-деплеции для обработки трансплантата ассоциировано с быстрым и надежным его приживлением, низким риском развития реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) и трансплантат-ассоциированной летальности (TRM) [1–4]. Вместе с тем данный подход сопровождается отсроченной иммунореконституцией и, как следствие, повышенным риском реактивации латентных вирусов и развития тяжелых оппортунистических инфекций (таких как цитомегаловирус (ЦМВ), вирус Эпштейна–Барр (ЭБВ), аденовирус (АДВ)) [5, 6]. Это определяет необходимость комплексной оценки восстановления патоген-специфичного иммунного ответа для ранней идентификации пациентов с высоким риском тяжелого течения оппортунистических инфекций и оптимизации стратегии противоинфекционной профилактики и терапии [7]. Лабораторная оценка содержания вирус-специфичных Т-лимфоцитов методом IFN-γ ELISPOT была внедрена в практику посттрансплантационного наблюдения реципиентов ТГСК в НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева в рамках клинического исследования инфузий донорских Т-лимфоцитов памяти для восстановления иммунной системы на платформе αβ-T-деплеции [8, 9].

Цель настоящей работы – исследование динамики восстановления вирус-специфичных Т-лимфоцитов после аллогенной ТГСК, выявления факторов, влияющих на сроки восстановления патоген-специфичной иммунореконституции, а также определение прогностической значимости полученных данных и их связи с клиническими исходами трансплантации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Из проспективно собранной базы данных ТГСК НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева отобраны пациенты, получившие аллогенную трансплантацию на платформе αβ-T-деплеции в период с сентября 2016 г. по март 2022 г. В группу включались пациенты, соответствующие следующим критериям: наличие злокачественного гематологического заболевания, выполнение первой аллогенной ТГСК, использование гаплоидентичного донора, клинико-гематологическая ремиссия на момент проведения трансплантации, зафиксированное приживление трансплантата, наличие как минимум одной контрольной точки с валидным результатом исследования IFN-γ ELISPOT. Из исследования исключены пациенты, умершие до +30-х суток (анализ невозможен, так как не достигнута первая контрольная точка).

Всего в исследование включены 265 пациентов, большинство из которых имели диагноз «острый лейкоз» (n = 239; 90%). Подробные характеристики когорты представлены в таблице 1. Группа из 129 пациентов входила в состав проспективного рандомизированного исследования, результаты которого были описаны ранее [8].

 

Таблица 1

Характеристика пациентов, доноров, режимов кондиционирования, профилактики РТПХ

Table 1

The characteristics of the patients, donors, conditioning regimens, and graft-versus-host disease (GVHD) prophylaxis

Параметр Parameter	Значение Value
Общее число пациентов, n Total number of patients, n	265
CD45Random, n	129
Возраст пациентов, медиана (диапазон), годы Patient age, the median (range), years	8,9 (0,4–18,3)
Пол пациентов: мужской:женский (соотношение) Patient sex, male:female (ratio)	174:91 (1,9:1,0)
IgG пациента к ЦМВ перед ТГСК, n (%) Recipient CMV IgG status before HSCT, n (%)	196 (74%) – IgG+ 60 (23%) – IgG– 9 (3%) – статус IgG неизвестен 9 (3%) – IgG status unknown
IgG донора к ЦМВ перед ТГСК, n (%) Donor CMV IgG status before HSCT, n (%)	257 (97%) – IgG+ 8 (3%) – IgG–
Диагнозы Diagnoses
Острый лейкоз, n (%) Acute leukemia, n (%)	239 (90)
ОМЛ, полная ремиссия, n (%) AML in complete remission, n (%)	66 (25)
ОЛЛ, n (%) ALL, n (%)	162 (61)
Другие злокачественные заболевания, n (%) Other malignancies, n (%)	37 (14)
НХЛ, n NHL, n	18
МДС, n MDS, n	2
ОБЛ, n ABL, n	15
Недифференцированный лейкоз, n Undifferentiated leukemia, n	1
ХММЛ, n СMML, n	1
ТГСК №1, n (%) First HSCT, n (%)	265 (100)
Кондиционирование и профилактика РТПХ Conditioning regimen and GVHD prophylaxis
ТОТ, n (%) ТBI, n (%)	159 (60)
Треосульфан, n (%) Treosulfan, n (%)	106 (40)
Бортезомиб, n (%) Bortezomib, n (%)	234 (88)
Абатацепт и тоцилизумаб, n (%) Abatacept and tocilizumab, n (%)	265 (100)
Время наблюдения среди выживших, медиана (диапазон), годы Follow-up time among survivors, the median (range), years	6 (3,2–8,7)

Примечание. CD45Random – проспективное рандомизированное исследование; ОМЛ – острый миелоидный лейкоз; ОЛЛ – острый лимфобластный лейкоз; НХЛ – неходжкинская лимфома; МДС – миелодиспластический синдром; ОБЛ – острый билинейный лейкоз; ХММЛ – хронический миеломоноцитарный лейкоз; ТОТ – тотальное облучение тела.

Note. CD45Random – a prospective randomized study; CMV – cytomegalovirus; HSCT – hematopoietic stem cell transplantation; AML – acute myeloid leukemia; ALL – acute lymphoblastic leukemia; NHL – non-Hodgkin lymphoma; MDS – myelodysplastic syndrome; ABL – acute bilineal leukemia; CMML – chronic myelomonocytic leukemia; TBI – total body irradiation.

 

Перед ТГСК 196 (74%) пациентов были серопозитивными по IgG к ЦМВ, 60 (23%) – серонегативными, в 9 (3%) случаях не было валидных результатов исследования инициального серологического статуса. Среди доноров 257 (97%) были серопозитивными и 8 (3%) – серонегативными. У всех пациентов был использован миелоаблативный режим кодиционирования на основе применения ТОТ в суммарной дозе 12 Гр (n = 159) или на основе треосульфана в курсовой дозе 42 г/м² (n = 106). В качестве профилактики РТПХ использовалась таргетная иммуномодулирующая терапия (абатацепт и тоцилизумаб). Детальное описание режима кондиционирования и профилактики РТПХ представлено в таблице 2. Посттрансплантационный мониторинг вирусной нагрузки (выявление ДНК ЦМВ, ЭБВ, вируса герпеса 6-го типа, АДВ в плазме крови) проводился еженедельно методом количественной полимеразной цепной реакции. Показанием к назначению терапии ганцикловиром или фоскарнетом натрия являлось выявление >500 копий/мл ЦМВ. Терапия проводилась до получения двух последовательных отрицательных тестов. Критерием ЦМВ-болезни являлись наличие клинических признаков и выявление вирусного генома в биологической жидкости (ликвор, внутриглазная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж) или ткани (биоптат желудка, кишечника). Восстановление общего и патоген-специфичного иммунного ответа оценивалось на +30, +60, +90, +180-е cутки и через 1 год после ТГСК методом проточной цитометрии и IFN-γ ELISPOT. Методика проведения IFN-γ ELISPOT в НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева ранее подробно описана в работе С.Л. Благова и соавт. [10]. Использовались антигены PepTivator CMV pp65-premium grade, PepTivator AdV5, Hexon-premium и PepTivator, EBV Consensus-premium grade, (Miltenyi Biotec, Бергиш–Гладбах, Германия). За положительный результат IFN-γ ELISPOT теста принималось выявление 10 вирус-специфичных лимфоцитов и более на 300 тыс. мононуклеарных клеток крови (МНК).

 

Таблица 2

Кондиционирование и профилактика РТПХ

Table 2

Conditioning regimen and GVHD prophylaxis

Терапия Therapy	Доза (∑) Doses (∑)	Дни Days
Кондиционирование Conditioning regimen
Треосульфан или TOT Treosulfan or TBI	42 г/м2 42 g/m2	–5, –4, –3
	12 Гр 12 Gy	–9, –8, –7
Тиотепа Thiotepa	10 мг/кг 10 mg/kg	–6, –5
Флударабин Fludarabin	150 мг/м2 150 mg/m2	–6, –5, –4, –3, –2
Ритуксимаб Rituximab	100 мг/м2 100 mg/m2	–1
Профилактика РТПХ GVHD prophylaxis
Тоцилизумаб Tocilizumab	8 мг/кг 8 mg/kg	–1
Абатацепт Abatacept	10 мг/кг* 10 mg/kg*	–1, +7, +14, +28
Бортезомиб Bortezomib	5,2 мг/м2* 5.2 mg/m2*	–5, –2, +2, +5

Примечание. ^* – разовая доза.

Note. ^* – single dose.

 

Статистический анализ

Для межгрупповых сравнений применяли U-тест Манна–Уитни. Кумулятивная вероятность ЦМВвиремии, ЦМВ-болезни оценивалась с учетом конкурирующих рисков. Целевым событием считали первое выявление >500 копий/мл ЦМВ в крови пациента после аллогенной ТГСК. В качестве конкурирующих событий рассматривали TRM до момента регистрации ЦМВ-виремии, а также рецидив или прогрессию основного заболевания. TRM считалась смерть от причин, не связанных с рецидивом или прогрессией основного заболевания. Конкурирующими событиями были рецидив или прогрессия основного заболевания. Для сравнения между группами был использован тест Файн–Грея. Связь между показателями патоген-специфичного иммунного ответа и показателями общей иммунореконституции анализировали с использованием линейной регрессии. В качестве зависимой переменной рассматривались количественные показатели патоген-специфичного иммунного ответа (число IFN-γ-продуцирующих клеток по данным ELISPOT), а в качестве независимых предикторов – абсолютное содержание основных субпопуляций лимфоцитов (CD3⁺-, CD3⁺CD8⁺-, CD3⁺CD4⁺-, NK-клетки). Для оценки силы связи использовались стандартизованные коэффициенты регрессии (β standardized); качество моделей характеризовалось коэффициентом детерминации (R²) и его скорректированным значением (adjusted R²). Для проведения статистического анализа была использована программа XLSTAT (Addinsoft, Франция). Выжившие пациенты были цензурированы 6 июня 2025 г. Медиана наблюдения для выживших пациентов составила 6 лет (3,2–8,7 года).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Кинетика патоген-специфичной иммунореконституции

Для оценки динамики восстановления ЦМВ-специфического Т-клеточного ответа проанализировано распределение количества ЦМВ-специфичных лимфоцитов на 300 тыс. МНК на +30, +60, +90, +180-е сутки и через 1 год после трансплантации (рисунок 1).

 

Рисунок 1

Динамика восстановления ЦМВ-специфичных T-лимфоцитов после ТГСК

Figure 1

The dynamics of CMV-specific T cell reconstitution after HSCT

 

Медиана ЦМВ-специфичных лимфоцитов увеличивалась в динамике с 2 на +30-е сутки до 98,5 через 1 год после трансплантации. Значительный межквартильный размах отражает высокую вариабельность восстановления патоген-специфичного иммунитета. Доля пациентов с положительным ЦМВ-специфическим ответом возрастала с 38,5% на +30-е сутки до 70% к +180-м суткам и 1 году после трансплантации (рисунок 2).

 

Рисунок 2

Доля пациентов с положительным и отрицательным ЦМВ-специфичным Т-клеточным ответом в различные сроки после аллогенной ТГСК

Figure 2

The proportion of the patients with positive and negative CMV-specific T cell responses at different time points after allogeneic HSCT

 

Медиана АДВ-специфичных лимфоцитов оставалась низкой на протяжении всего периода наблюдения: 0 на +30-е и +60-е сутки, с постепенным увеличением до 1 на +90-е сутки, до 4 на +180-е сутки и до 8 через 1 год после трансплантации (рисунок 3). Несмотря на рост верхнего квартиля (до 34 к 1 году), общая вариабельность ответа оставалась значительно ниже по сравнению с ЦМВ-специфичным ответом, что отражает более медленное и ограниченное восстановление АДВ-специфичного иммунитета. Доля пациентов с положительным ELISPOT оставалась относительно низкой на ранних сроках после ТГСК: 7% на +30-е сутки, 16% на +90-е сутки с увеличением до 38% и 49% через 180 сут и 1 год после трансплантации (рисунок 4). Таким образом, восстановление АДВ-специфичного Т-клеточного иммунного ответа происходило значительно медленнее, чем ЦМВ-специфичного, и характеризовалось меньшей частотой положительных тестов и более низкими медианными значениями количества IFN-γ-секретирующих клеток.

 

Рисунок 3

Динамика восстановления АДВ-специфичных Т-лимфоцитов после ТГСК

Figure 3

The dynamics of ADV-specific T cell reconstitution after HSCT

ADV – adenovirus

 

Рисунок 4

Доля пациентов с положительным и отрицательным АДВ-специфичным Т-клеточным ответом в различные сроки после аллогенной ТГСК

Figure 4

The proportion of the patients with positive and negative ADV-specific T cell responses at different time points after allogeneic HSCT

 

В раннем посттрансплантационном периоде (до 90-х суток) медианные значения количества ЭБВ-специфичных IFN-γ-продуцирующих клеток оставались равными 0, что отражает отсутствие или минимальную вирус-специфичную Т-клеточную реактивность у большинства пациентов. Лишь к +180-м суткам медиана повысилась до 0,25, а к концу первого года – до 0,5 (рисунок 5). При этом верхний квартиль достигал 2,85 и 4,5 соответственно, что свидетельствует о крайне ограниченном диапазоне восстановления ЭБВ-специфичного иммунного ответа даже через 1 год после трансплантации.

 

Рисунок 5

Динамика восстановления ЭБВ-специфичных Т-лимфоцитов после ТГСК

Figure 5

The dynamics of EBV-specific T cell reconstitution after HSCT

EBV – Epstein-Barr virus

 

Доля пациентов с положительным ELISPOT к ЭБВ оставалась низкой на протяжении всего периода наблюдения: около 4% на +30-е и +60-е сутки, 6% на +90-е сутки, составив 22% к концу первого года (рисунок 6). Таким образом, восстановление ЭБВ-специфичных Т-лимфоцитов после аллогенной ТГСК происходило значительно медленнее и в меньшей степени, чем для ЦМВ и АДВ, что отражает относительно низкую вероятность экспозиции к ЭБВ.

 

Рисунок 6

Доля пациентов с положительным и отрицательным ЭБВ-специфичным Т-клеточным ответом в различные сроки после аллогенной ТГСК

Figure 6

The proportion of the patients with positive and negative EBV-specific T cell responses at different time points after allogeneic HSCT

 

Серологический статус донора и реципиента

Среди пациентов с ЦМВ-негативным донором большая часть не имела ЦМВ-специфичных лимфоцитов на +30-е сутки, максимальное значение – 2, в то время как в группе с ЦМВ-позитивным донором зафиксирована значительно большая вариабельность ЦМВ-специфичного иммунного ответа, максимальное значение – 1595 (рисунок 7). Однако при межгрупповом сравнении по серологическому статусу донора (IgG донора к ЦМВ – отрицательный против положительного) на 30-е сутки после ТГСК различия в количестве ЦМВ-специфичных лимфоцитов продемонстрировали лишь тенденцию без достижения статистической значимости (p = 0,061), что может быть обусловлено малым объемом группы реципиентов с ЦМВ-негативным донором.

 

Рисунок 7

Восстановление ЦМВ-специфичного иммунного ответа на 30-е сутки после ТГСК в группах с ЦМВпозитивным и ЦМВ-негативным донором

Figure 7

The reconstitution of CMV-specific immune response on day +30 after HSCT in the CMV-seropositive and CMV-seronegative donor groups

 

В группе ЦМВ-серопозитивных реципиентов регистрировалось существенно большее число ЦМВ-специфичных лимфоцитов по сравнению с группой ЦМВ-серонегативных реципиентов (p < 0,0001) (рисунок 8). Также доля ELISPOT-позитивных результатов на +30-е сутки была значимо выше у ЦМВ-серопозитивных реципиентов (p < 0,0001) по сравнению с ЦМВ-серонегативными: 46% против 10% (рисунок 9).

 

Рисунок 8

Восстановление ЦМВ-специфичного иммунного ответа на 30-е сутки после ТГСК в группах с ЦМВпозитивным и ЦМВ-негативным реципиентом

Figure 8

The reconstitution of CMV-specific immune response on day +30 after HSCT in the CMV-seropositive and CMV-seronegative recipient groups

 

Рисунок 9

Восстановление ЦМВ-специфичного иммунного ответа на 30-е сутки после ТГСК в группах с ЦМВпозитивным и ЦМВ-негативным реципиентом

Figure 9

The reconstitution of CMV-specific immune response on day +30 after HSCT in the CMV-seropositive and CMV-seronegative recipient groups

 

Системная иммуносупрессивная терапия

Выполнен анализ формирования ЦМВ-специфичного иммунного ответа в зависимости от проведения системной иммуносупрессивной терапии, включая глюкокортикостероиды, пациентам с острой и хронической РТПХ. На +30-е сутки от трансплантации положительный ELISPOT-ответ к ЦМВ определялся у 25% пациентов, получавших иммуносупрессивную терапию, и у 39% пациентов без иммуносупрессивной терапии на момент обследования (p = 0,4). На +60-е сутки доля ELISPOT-позитивных пациентов составила 42% и 53% соответственно (p = 0,3), на +90-е сутки – 63% и 60% соответственно (p = 0,7), на +180-е сутки – 70% и 68% соответственно (p = 0,8), через 1 год после аллогенной ТГСК – 63% и 64% соответственно (p = 0,9). Таким образом, статистически значимых различий в частоте формирования ЦМВ-специфичного ELISPOT-ответа между пациентами, получавшими и не получавшими системную иммуносупрессивную терапию на момент обследования, выявлено не было ни в одной из анализируемых временных точек. При сравнении количественных значений ELISPOT между указанными подгруппами также не было выявлено статистически значимых различий.

Корреляция общей и патоген-специфичной иммунореконституции

Установлена положительная ассоциация количества вирус-специфичных Т-лимфоцитов на +30-е сутки от аллогенной ТГСК с абсолютными численностями основных субпопуляций Т-лимфоцитов (рисунок 10). С цитотоксическими Т-лимфоцитами (CD3⁺8⁺) линейная регрессия показала наибольшую силу связи (R² = 0,43, β standardized = 0,656; p < 0,0001). С общей численностью Т-лимфоцитов (CD3⁺) выявлена умеренная связь (R² = 0,38, β standardized = 0,59; p < 0,0001). Наиболее слабая связь установлена с T-хелперами (CD3⁺4⁺) (R² = 0,128, β standardized = 0,358; p < 0,0001). Как показано на рисунке 11, на +60-е и +90-е сутки от аллогенной ТГСК сила связи количества патоген-специфичных лимфоцитов с численностью CD3⁺8⁺ снижалась, но сохраняла статистическую значимость (p < 0,0001). Через 1 год после ТГСК связь существенно ослабевала и статистической значимости не достигала (R² = 0,005, β standardized = 0,223; p = 0,058).

 

Рисунок 10

Корреляция восстановления ЦМВ-специфичного иммунного ответа с основными субпопуляциями Т-лимфоцитов на +30-е сутки от ТГСК

Figure 10

A correlation between the reconstitution of CMV-specific immune response and major T cell subpopulations on day +30 after HSCT

 

Рисунок 11

Корреляция восстановления ЦМВ-специфичного иммунного ответа с восстановлением цитотоксических Т-лимфоцитов на +60-е, +90-е сутки и +1 год от ТГСК

Figure 11

A correlation between the reconstitution of CMV-specific immune response and recovery of cytotoxic T cells on day +60, day +90 and at 1 year after HSCT

 

Цитомегаловирусная инфекция

ЦМВ-виремия выявлена у 134 пациентов, кумулятивная вероятность реактивации ЦМВ во всей группе составила 49% (95% доверительный интервал (ДИ) 44–56) (рисунок 12А) на медианном сроке 40 (6–202) дней после ТГСК. В группе пациентов с положительным значением ELISPOT на +30-е сутки кумулятивная вероятность реактивации ЦМВ-виремии составила 57% (95% ДИ 47–68), в группе с отрицательным значением ELISPOT на +30-е сутки – 42% (95% ДИ 35–51) (p = 0,012) (рисунок 12Б).

 

Рисунок 12

Кумулятивная вероятность ЦМВ-виремии: А – в общей популяции; Б –среди пациентов с положительным и отрицательным значениями ELISPOT на +30-е сутки от ТГСК (log-rank, p = 0,012)

Figure 12

The cumulative incidence of CMV viremia: А – in the overall study cohort; Б – in the patients with positive and negative ELISPOT results on day +30 after HSCT (log-rank, p = 0.012)

 

ЦМВ-болезнь диагностирована у 47 пациентов, кумулятивная вероятность развития во всей группе – 12% (95% ДИ 8–16) (рисунок 13А). Медиана развития ЦМВ-болезни – 109 дней. В группе пациентов, у которых на +60-е сутки от ТГСК выявлены положительные значения ELISPOT, кумулятивная вероятность развития ЦМВ-болезни была ниже – 8% (95% ДИ 5–16), чем при положительных результатах ELISPOT – 17% (95% ДИ 12– 26) (p = 0,143) (рисунок 13Б).

 

Рисунок 13

Кумулятивная вероятность развития ЦМВ-болезни: А – в общей популяции; Б – среди пациентов с положительным и отрицательным значениями ELISPOT на +60-е сутки от ТГСК (log-rank, p = 0,143)

Figure 13

The cumulative incidence of CMV disease: А – in the overall study cohort; Б – in the patients with positive and negative ELISPOT results on day +60 after HSCT (log-rank, p = 0.143)

 

Средняя длительность ЦМВ-виремии составила 5 нед (диапазон – 1–36 нед). В группе пациентов с положительным значением ELISPOT на +60-е сутки – 4 нед (диапазон – 1–13 нед), что значимо меньше, чем в группе с отрицательным значением – 6 нед (диапазон – 1–36 нед) (p = 0,023) (рисунок 14А). Максимальная вирусная нагрузка среди пациентов с положительным значением ELISPOT на +60-е сутки также достоверно ниже, чем среди пациентов с отрицательным результатом: 9587 копий/мл (диапазон – 376–150 000 копий/мл) против 23 525 копий/мл (диапазон – 421–2 210 000 копий/мл) (p = 0,029) (рисунок 14Б).

 

Рисунок 14

Длительность ЦМВ-виремии (А), максимальная вирусная нагрузка (Б) и длительность противовирусной терапии (В) среди пациентов с положительным и отрицательным значением ELISPOT на +60-е сутки от ТГСК

Figure 14

The duration of CMV viremia (А), the peak viral load (Б) and the duration of antiviral therapy (В) in the patients with positive and negative ELISPOT results on day +60 after HSCT

 

Средняя длительность противовирусной терапии cоставила 36 дней (диапазон – 5–206 дней). Среди пациентов c положительным значением ELISPOT на +60-е сутки от ТГСК зафиксирована тенденция к более низкой продолжительности противовирусной терапии – 33 дня (диапазон – 5–140 дней) против 46 дней (диапазон – 8–206 дней) в группе с отсутствием ЦМВ- специфичных лимфоцитов (p = 0,097) (рисунок 14В). Один пациент с ЦМВ-виремией 1000 коп/мл на +30-е сутки от ТГСК не получал противовирусную терапию в связи с высоким показателем ЦМВ-специфичных лимфоцитов – 597 и самостоятельно нивелировал виремию в течение 2 нед. Статистически значимой связи между наличием ЦМВ-специфичных лимфоцитов на +30-е или +60-е сутки от ТГСК и частотой эскалации противовирусной терапии (назначение фоскарнета натрия, цидофовира) не выявлено (χ², p = 0,075). По данным ранговой корреляции Спирмена выявлена слабая, но статистически значимая отрицательная связь между количеством ЦМВ-специфичных лимфоцитов и временем терапии (ρ = –0,210; p = 0,03), при этом R² составил 0,044. При анализе взаимосвязи количества ЦМВ-специфичных лимфоцитов на +60-е сутки от ТГСК и длительностью виремии также имеется слабая, но статистически значимая отрицательная связь (ρ = –0,253; p = 0,009; R² = 0,064). Таким образом, более высокое число ЦМВ-специфичных лимфоцитов на +60-е сутки ассоциируется с несколько меньшей длительностью виремии и противовирусной терапии.

Повторные эпизоды реактивации ЦМВ-виремии выявлены у 18 пациентов. Медиана реактивации ЦМВ-виремии составила 115 дней (диапазон – 40–202 дня) после ТГСК. Кумулятивная вероятность повторной реактивации ЦМВ-виремии к 1 году после ТГСК – 6% (95% ДИ 4–10). В когорте пациентов, имеющих ЦМВ-специфичные лимфоциты на +30-е сутки, вероятность повторной реактивации составила 8% (95% ДИ 3–20) по сравнению с пациентами, не имеющими ЦМВ-специфичного иммунного ответа – 12% (95% ДИ 6–24) (p = 0,44).

Трансплантат-ассоциированная смертность

Всего зафиксировано 17 случаев смерти от причин, не связанных с рецидивом основного заболевания. Структура причин, определивших TRM, представлена в таблице 3. Кумулятивный риск TRM в общей популяции составил 3% (95% ДИ 2–6). Пациенты с положительным результатом ELISPOT к ЦМВ на +30-е сутки от ТГСК имели тенденцию к более низкому риску TRM (кумулятивный риск через 1 год после ТГСК – 1% (95% ДИ 0,1– 8,0)) по сравнению с пациентами, не имевшими патоген-специфичного иммунного ответа (кумулятивный риск TRM через 1 год после ТГСК – 4% (95% ДИ 2–9)), однако данное различие не имело статистической значимости (p = 0,798) (рисунок 15).

 

Таблица 3

Структура трансплантат-ассоциированной смертности

Table 3

Causes of transplant-related mortality

№	РТПХ GVHD	Другие причины TRM Other TRM causes
1	Нет No	АДВ, ЦМВ, сепсис ADV, CMV, sepsis
2	Да Yes	Cепсис Sepsis
3	Нет No	АДВ, ЦМВ, сепсис ADV, CMV, sepsis
4	Да Yes	Covid-19
5	Да Yes	ЦМВ, сепсис CMV, sepsis
6	Да Yes	АДВ, ЦМВ, сепсис ADV, CMV, sepsis
7	Да Yes	Полиорганная недостаточность Multiple organ dysfunction
8	Да Yes	АДВ, сепсис ADV, sepsis
9	Нет No	Пневмония неуточненная Unspecified pneumonia
10	Нет No	Covid-19
11	Да Yes	ЦМВ, АДВ, сепсис, грибковая инфекция CMV, ADV, sepsis, fungal infection
12	Да Yes	ЦМВ CMV
13	Да Yes	Cепсис Sepsis
14	Нет No	АДВ, ЦМВ, сепсис(?) ADV, CMV, sepsis(?)
15	Да Yes	Covid-19
16	Да Yes	ЦМВ, АДВ CMV, ADV
17	Да Yes	Грибковая и бактериальная инфекции Fungal and bacterial infections

 

Рисунок 15

Кумулятивная вероятность TRM среди пациентов с положительным и отрицательным значениями ELISPOT на +30-е сутки от ТГСК (log-rank, p = 0,798)

Figure 15

The cumulative incidence of transplant-related mortality (TRM) in the patients with positive and negative ELISPOT results on day +30 after HSCT (log-rank, p = 0.798)

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы были исследование динамики восстановления патоген-специфичного иммунного ответа к ЦМВ, АДВ и ЭБВ после аллогенной ТГСК на платформе αβ-T-деплеции, сопоставление результатов ELISPOT к ЦМВ c клиническими исходами (реактивация оппортунистических вирусных инфекций, тяжесть течения вирусных инфекций, TRM), а также оценка влияния различных факторов на показатель ELISPOT (серологический статус донора и реципиента, реконституция основных субпопуляций лимфоцитов).

Анализ кинетики восстановления вирус-специфичных Т-лимфоцитов показал выраженные различия в скорости и интенсивности восстановления иммунного ответа к ЦМВ, АДВ и ЭБВ. Наиболее быстрое и выраженное восстановление наблюдалось для ЦМВ-специфичных Т-клеток: медианное количество IFN-γ-продуцирующих клеток увеличивалось с 2 до 95,8 в течение первого года после трансплантации, а доля пациентов с положительным тестом достигала более 70% к +180-м суткам. В противоположность этому восстановление АДВ-специфичного иммунного ответа носило замедленный характер – медианные значения не превышали 8 к концу первого года, а доля положительных тестов составляла около 30%. Наиболее низкие показатели отмечены для ЭБВ-специфичных лимфоцитов: медианные значения IFN-γ ELISPOT оставались близкими к нулю даже через 1 год после трансплантации, а положительный ответ регистрировался менее чем у 20% обследованных пациентов. Такое распределение отражает различия в частоте латентной персистенции, интенсивности антигенной стимуляции и составе донорского пула Т-литмфоцитов памяти. Более быстрые темпы восстановления ЦМВ-специфичного Т-клеточного ответа после аллогенной ТГСК биологически объяснимы высоким уровнем серопозитивности у доноров и реципиентов [11, 12], а также высокой частотой ЦМВ-специфичных Т-лимфоцитов памяти в крови здоровых серопозитивных доноров, что обеспечивает эффективный перенос пула клеток памяти, способных к быстрой пролиферации под воздействием стимуляции антигеном [13]. Медленное восстановление патоген-специфичного иммунного ответа к ЭБВ обусловлено отсутствием антигенной стимуляции в результате CD19-деплеции [5].

Полученные нами результаты о замедленном восстановлении ЦМВ-специфичного иммунного ответа у пациентов с ЦМВ-негативным донором соответствуют опубликованным данным, свидетельствующим о том, что сочетание серонегативного донора и серопозитивного реципиента является наименее благоприятным по рискам ЦМВ-реактивации [5, 14, 15]. Наблюдавшаяся у нас лишь тенденция к различиям между ЦМВ-негативными и ЦМВ-позитивными донорами на +30-е сутки (p = 0,061), вероятно, обусловлена малой численностью группы ЦМВ-негативных доноров. Значительное улучшение восстановления патоген-специфичного иммунного ответа к ЦМВ на +30-е сутки в подгруппе серопозитивных реципиентов соответствует нашим результатам, полученным в предыдущем исследовании [8], и подтверждает роль антигенной стимуляции в пролиферации вирус-специфичных Т-лимфоцитов.

При анализе взаимосвязи вариабельности ЦМВ-специфичного IFN-γ ELISPOT с основными субпопуляциями лимфоцитов выявлена статистически значимая зависимость от численности CD3⁺CD8⁺-лимфоцитов на +30-е сутки (наиболее сильная связь среди субпопуляций). Полученные данные согласуются с результатами работы Stern и соавт., в которой ускоренное восстановление CD8⁺ Т-клеток при реактивации ЦМВ ассоциировалось с контролем вируса и более благоприятной динамикой виремии [16].

Снижение силы зависимости результатов ELISPOT от абсолютного числа Т-цитотоксических лимфоцитов в течение 1 года после ТГСК (до потери статистической значимости) объясняется вкладом антигензависимой экспансии донорских клеток памяти в общий пул Т-лимфоцитов на ранних сроках после трансплантации [17, 18]. Как описано в работе Zvyagin и соавт., раннее восстановление численности αβ-T-клеток (около 2 мес после ТГСК) обусловлено экспансией ограниченного числа клонов, происходящих из недеплетированных клеток трансплантата, тогда как истинное расширение TCR-репертуара происходит лишь к 12-му месяцу после трансплантации за счет тимусзависимой генерации наивных Т-лимфоцитов.

Анализ кумулятивной вероятности реактивации ЦМВ-виремии показал обратную зависимость: у пациентов с ELISPOT-позитивностью к ЦМВ на +30-е сутки риск развития ЦМВ-виремии и ЦМВ-болезни оказался достоверно выше, чем у ELISPOT-негативных. В данном случае ELISPOT фиксирует ответ, индуцированный субклинической репликацией ЦМВ, предшествующей лабораторной виремии. Таким образом, позитивные значения ELISPOT-теста на ранних сроках после ТГСК указывают не на способность к контролю вируса, а на продолжающуюся антигенную стимуляцию. В литературе описаны и противоположные наблюдения, например, в работе Nesher и соавт., где высокий ELISPOT к +100-му дню снижал риск ЦМВ-реактивации [19, 20]. Различия во временном окне тестирования (более поздняя оценка ELISPOT на +100-е сутки от ТГСК), составах когорт, платформе ТГСК (взрослые реципиенты без αβ-T-деплеции) и порогах ELISPOT (в работе Nesher использовались высокие пороги для позитивного значения ELISPOT – 100 SFC/2,5 × 10⁵ MNC) объясняют расхождение направленности ассоциаций. Более высокая вероятность развития ЦМВ-болезни в когорте пациентов, имевших ЦМВ-специфичные лимфоциты, вероятно, отражает тот факт, что болезнь и есть клиническое оформление иммунного ответа на инфекцию, поэтому при наличии пула вирус-специфичных лимфоцитов развивается более яркое течение инфекционного процесса.

К +60-м суткам в нашей когорте ELISPOT-позитивность коррелировала с более благоприятным течением виремии (меньшая длительность и более низкий пик вирусной нагрузки, тенденция к снижению длительности противовирусной терапии), что отражает формирование функциональной компетентности ЦМВ-специфического Т-клеточного ответа по мере иммунореконституции [17]. Это соответствует данным работ, где положительные результаты ELISPOT на более поздних временных точках являлись предикторами снижения риска клинически значимой ЦМВ-реактивации и позволяли стратифицировать пациентов по вероятности эпизодов реактивации вируса [19, 21, 22]. Различия в длительности противовирусной терапии не достигли статиcтической значимости. Наиболее вероятно, это обусловлено тем, что решение об отмене противовирусной терапии принималось с учетом совокупности клинических факторов: у пациентов с высоким риском реактивации или генерализации вирусной инфекции (в частности, получавших кортикостероиды в рамках терапии РТПХ) лечение продолжали в профилактических дозах, несмотря на минимальные уровни виремии и удовлетворительную патоген-специфичную иммунную реконституцию.

Среди пациентов, вошедших в анализ, противовирусная терапия назначалась всем при обнаружении ЦМВ в крови >500 копий/мл независимо от результатов ELISPOT, что не дает возможности судить о необходимости назначения терапии пациентам с высоким уровнем ЦМВ-специфичных Т-лимфоцитов. Наличие ЦМВ-специфичных лимфоцитов на +30-е сутки сопровождалось тенденцией к снижению кумулятивной вероятности повторной реактивации ЦМВ-виремии. Отсутствие статистически значимых различий, по-видимому, связано с ограниченным числом эпизодов повторной виремии и, как следствие, недостаточной статистической мощностью анализа, что не позволяет окончательно оценить защитную роль патоген-специфичного ответа в отношении поздних эпизодов ЦМВ-инфекции.

Кумулятивный риск TRM составил 3% (95% ДИ 2–6), что сопоставимо с современными показателями для детской аллогенной ТГСК на платформе αβ-T-деплеции [23] и согласуется c данными, опубликованными нами ранее [24, 25]. Вирусные инфекции занимают значимое место в структуре причин TRM у пациентов, получивших аллогенную ТГСК с αβ-Tдеплецией [26]. Согласно данным Glushkova и соавт., более высокое абсолютное число Т-лимфоцитов на +30-е сутки от ТГСК ассоциировано со снижением риска TRM [27]. В настоящем анализе выявлена лишь тенденция к более низкому риску TRM у ELISPOTпозитивных на +30-е сутки пациентов. Наиболее вероятным объяснением является воздействие совокупности факторов: помимо вклада ЦМВ и AДВ в летальность у большинства пациентов существенное влияние оказывали РТПХ (у 9 из 14), а также инвазивные грибковые и бактериальные инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, экспозиция к антигену играет ключевую роль в восстановлении патоген-специфичного иммунного ответа, о чем свидетельствуют более интенсивные темпы восстановления ЦМВ-специфичного иммунного ответа в сравнении с иммунитетом к ЭБВ и АДВ, а также более быстрое появление ЦМВ-специфичных Т-лимфоцитов у ЦМВ-позитивных реципиентов, среди пациентов с ЦМВ-позитивным донором и при развитии ЦМВ-виремии. На ранних сроках после ТГСК количество ЦМВ-специфичных лимфоцитов наиболее тесно связано с численностью CD3⁺CD8⁺-лимфоцитов, по мере отдаления от трансплантации сила этой связи снижается, что отражает вклад экспансии донорских клеток памяти в регенерацию Т-клеточного иммунитета на раннем сроке после ТГСК. Раннее появление ЦМВ-специфичных Т-клеток сокращает длительность виремии, снижает максимальную вирусную нагрузку. Динамическая оценка результатов IFN-γ ELISPOT может использоваться как инструмент стратификации риска и разработки персонализированной стратегии противовирусной терапии в педиатрической когорте после аллогенной ТГСК.

ВКЛАД АВТОРОВ

Все авторы в равной степени внесли свой вклад в рукопись, рассмотрели ее окончательный вариант и дали согласие на публикацию.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

All the authors contributed to the manuscript equally, reviewed the final version and agreed to its publication.

ЭТИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА

В данном ретроспективном исследовании использованы деперсонифицированные данные пациентов, поэтому оно не требовало одобрения этическим комитетом.

ETHICS REVIEW

Ethical approval was not required for this retrospective study, as only anonymized patient data were used.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Данное исследование не имело финансовой поддержки от сторонних организаций.

FUNDING

No funding was received for this study.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

CONFLICT OF INTEREST

The authors confirm that there is no conflict of interest to declare.

About the authors

Maria A. Dunaykina

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1384-1752

a hematologist at Hematopoietic Stem Cell Transplantation Department No.1

Russian Federation, Moscow

L. N. Shelikhova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0520-5630
Russian Federation, Moscow

S. L. Blagov

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8754-1376
Russian Federation, Moscow

M. A. Klimentova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1216-817X
Russian Federation, Moscow

M. E. Perminova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7387-9197
Russian Federation, Moscow

E. Yu. Osipova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1873-3486
Russian Federation, Moscow

R. V. Nikolaev

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7281-5354
Russian Federation, Moscow

M. V. Efimenko

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4075-3133
Russian Federation, Moscow

G. G. Solopova

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1680-7269
Russian Federation, Moscow

D. N. Balashov

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2689-0569
Russian Federation, Moscow

A. A. Maschan

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0016-6698
Russian Federation, Moscow

M. A. Maschan

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: centrles.it@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1735-0093
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files