Multiparametric model of noninvasive diagnosis of neuroblastoma in children based on a novel liquid biopsy marker C18 GD2 and serum tumor markers

Full Text

Нейробластома (НБ) является одной из наиболее частых злокачественных экстракраниальных опухолей детского возраста и характеризуется выраженной биологической и клинической гетерогенностью [1]. НБ является третьим по частоте встречаемости злокачественным заболеванием в педиатрической практике [2].

Важную роль в диагностике НБ играют инструментальные методы обследований [2].

В то же время при первичной постановке диагноза НБ широко применяется определение уровня онкомаркеров – нейронспецифической енолазы (НСЕ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), однако эти маркеры могут быть повышены и при других злокачественных или доброкачественных образованиях и не обладают высокой чувствительностью и специфичностью [3].

На сегодняшний день жидкостная биопсия рассматривается как одно из ключевых направлений развития прецизионной медицины в детской онкологии, в том числе при ведении пациентов с НБ [4]. В этом контексте особый интерес представляет дисиалоганглиозид (GD2) – специфический ганглиозид, преимущественно экспрессируемый на плазматической мембране клеток НБ. Степень экспрессии GD2 зависит от степени дифференцировки нейрогенных опухолей и максимальна при НБ по сравнению с ганглионейробластомой и ганглионейромой [5, 6]. GD2 «сбрасывается» с поверхности опухолевых клеток и определяется в системном кровотоке, что делает его перспективным биомаркером для неинвазивной диагностики НБ [7, 8].

Валидированный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) [9] позволяет количественно определять циркулирующий GD2 в периферической крови [10], обеспечивая более экономичный, надежный и воспроизводимый подход по сравнению с ранее использовавшимися методами [11]. C18-липоформа GD2 является предоминантной и не обнаруживается в высоких количествах у здоровых детей, но присутствует в крови у пациентов с НБ [10, 12, 13], однако проспективных работ в этой области фактически нет.

В настоящий момент в рамках диагностики НБ традиционно используется определение концентраций опухолевых маркеров НСЕ и ЛДГ, однако их индивидуальная диагностическая информативность ограничена, при этом лимитированные публикации в основном оценивают диагностическую и прогностическую роль C18-липоформы GD2 как одиночного маркера жидкостной биопсии [10, 12, 13], а многопараметрические диагностические модели, объединяющие циркулирующую C18-липоформу GD2 с сывороточными опухолевыми маркерами (НСЕ и ЛДГ) у детей в литературе вовсе отсутствуют.

В нашей работе мы применили метод ВЭЖХ-МС/МС для определения циркулирующей C18-липоформы GD2 в образцах крови, проспективно собранных у детей с подозрением на нейрогенную опухоль до установления диагноза и начала какого-либо лечения, как правило, в день поступления или непосредственно перед оперативным вмешательством/биопсией, и одновременно регистрировали уровни НСЕ и ЛДГ. Ни в одном случае образцы крови не отбирались после начала специфической противоопухолевой терапии. В данном исследовании рассматривается диагностический контекст: задача модели – предсказать наличие НБ у пациентов с подозрением на нейрогенную опухоль до получения гистологического заключения на основании жидкостной биопсии, основанной на измерении циркулирующей С18-липоформы GD2 в крови и сывороточных опухолевых маркеров НСЕ и ЛДГ. На этом фоне целесообразными представляются разработка и внутренняя валидация многовариантной логистической модели, объединяющей указанные маркеры, с последующим созданием удобного для практического применения калькулятора риска диагностики НБ.

Цель настоящей работы – разработка и внутренняя валидация многопараметрической логистической регрессионной модели неинвазивной диагностики НБ у детей на основе сочетания С18-липоформы GD2 (маркера жидкостной биопсии) и сывороточных опухолевых маркеров НСЕ и ЛДГ.

Дополнительной задачей было оценить, улучшает ли использование более сложного алгоритма (нейросетевой модели типа многослойного персептрона с теми же предикторами) диагностическую эффективность по сравнению с классической логистической регрессией, и на основании полученных результатов обосновать выбор итоговой модели для практического применения (калькулятор риска).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При подготовке статьи мы руководствовались стандартами отчетности об исследованиях точности диагностики STARD (Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy Studies) [14]. Исследование имело проспективный, одноцентровый, диагностический дизайн когортного типа: в него последовательно включались пациенты с клинико-инструментальным подозрением на нейрогенную опухоль (в том числе НБ), которые до начала хирургического лечения/инициации специфической терапии проходили обследование в ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России.

Критериями включения являлись возраст на момент установления диагноза (0–18 лет), наличие подозрения на нейрогенную опухоль, а также подписанное информированное добровольное согласие законных представителей/пациента на участие в исследовании. Критерием исключения являлось отсутствие подписанного информированного добровольного согласия.

Рекрутинг пациентов проводился в период с июля 2021 г. по март 2024 г. (32 мес). Дата отсечения данных для анализа и определения исходов – 11 марта 2025 г., к этому моменту исход заболевания был установлен для всех включенных пациентов.

Всем пациентам до морфологической верификации выполнялось определение концентраций С18-липоформы GD2 в крови (жидкостная биопсия), при этом концентрации НСЕ и ЛДГ измерялись по возможности в рамках той же госпитализации (до начала специфической терапии – хирургического лечения/химиотерапии).

Концентрации опухолевых маркеров НСЕ и ЛДГ определяли в клинико-диагностической лаборатории по стандартным методикам. Определение концентраций C18-липоформы GD2 осуществлялось в лаборатории молекулярной иммунологии посредством применения ранее описанного и валидированного метода ВЭЖХ-МС/МС [9, 10] с незначительными изменениями.

Образцы плазмы, стабилизированной этилендиаминтетрауксусной кислотой, осаждали метанолом в соотношении 1 к 8, содержащим N-омега-CD3-октадеканоилмоносиалоганглиозид GM1 (GM1-D3, ООО «Матрея») в качестве внутреннего стандарта (IS) в конечной концентрации 1,5 мкг/мл. Образцы перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре, затем отделяли супернатант последовательным центрифугированием при 14 000g и +4°С. Образцы разделяли на колонке ShimPack GIST C18 150*4,6 мм с диаметром пор 5 мкм при комнатной температуре в градиенте подвижных фаз (А – 10% 20 mM NH₄CH₃O₂, 90% CH₃OH; Б – 100% изопропанол), подаваемых с постоянной скоростью 1 мл/мин. Пробы анализировали на масс-спектрометре Shimadzu LCMS-8030, оснащенном 2 насосами LC-20AD, автоматическим пробоотборником SIL-20A, дегазационной установкой DGU-20A5R и системным контроллером CBM-20A.

Обнаружение веществ осуществлялось в режиме отрицательной ионизации методом наблюдения множественных реакций по следующим фрагментам: GD2 836,3 m/z → 289,9 m/z при энергии соударения 41 eV; IS 1547,7 m/z → 290 m/z при энергии соударения 50 eV. Азот использовался в качестве газа завесы и носителя (скорость подачи – 2,7 л/мин и 15 л/мин соответственно). Температура нагревательного блока – 450°С, линии испарения – 260°С.

Для обработки данных использовалось программное обеспечение Lab Solutions. Линейная калибровка выполнялась при каждом запуске в диапазоне 15–960 нМ для C18-липоформы GD2 (Sigma, содержание C18-липоформы GD2 составило 32%). Все образцы и стандарты применялись в двух повторениях.

Модель неинвазивной диагностики НБ разрабатывалась и внутренне валидировалась на этой же выборке пациентов, отдельного внешнего набора данных для валидации модели не формировалось. В модель включали 3 непрерывных предиктора: концентрации С18-липоформы (нМ), НСЕ (нг/мл) и ЛДГ (Ед/л).

Предсказываемым исходом модели являлось наличие НБ. «Золотым стандартом» служил морфологический диагноз: НБ подтверждалась или исключалась по результатам гистологического исследования операционного материала и/или цитологического/морфологического исследования костного мозга на основании соответствия одному из трех международных критериев [15]. Определение степени распространенности опухолевого процесса осуществлялось в соответствии с международной системой стадирования НБ INSS (International Neuroblastoma Staging System) [15] и международной системой стадирования групп риска НБ INRGSS (International Neuroblastoma Risk Group Staging System) [16]. Для стратификации пациентов по группам риска использовались критерии протокола Немецкого общества детских онкологов и гематологов (Gesellschaft für Pädiatrische Onkologie und Hämatologie) – NB 2004 (главный исследователь – профессор F. Berthold) [17]. Патоморфологическое заключение формировалось в рамках стандартного клинического процесса и независимо от разрабатываемой модели. Результаты определения опухолевых маркеров могли быть доступны лечащим врачам, однако специально не использовались при установлении морфологического диагноза. Формального протокола ослепления патоморфологов относительно концентраций С18-липоформы GD2, НСЕ и ЛДГ не применялось.

Пациенты с ганглионейромой и иными заболеваниями рассматривались как контрольная группа и включались в анализ без исключений.

Статистический анализ

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного продукта IBM SPSS Statistics 23.0 и среды R (версия 4.5.3). Априорный расчет размера выборки не проводился: в анализ включали всех пациентов, соответствующих критериям отбора. Для описания качественных переменных использовались абсолютные значения признака и проценты. Для проверки гипотезы о нормальности закона распределения количественных переменных применялись критерии Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса и Шапиро–Уилка. В связи с отличным от нормального распределением количественных переменных в качестве описательной статистики использовалось представление вида Me (Q1–Q3), где Me – медиана, Q1 и Q3 – 1-й (25%) и 3-й (75%) квартили соответственно. Критический уровень значимости р установлен на уровне 0,05 (двусторонний).

Обработка пропусков и множественная импутация

Концентрации С18-липоформы GD2 и возраст на момент установления диагноза были доступны для всех пациентов. Для НСЕ и ЛДГ отмечалась значительная доля пропусков, особенно в контрольной группе, поэтому дальнейший анализ выполнялся с использованием множественной импутации пропусков. Для учета неполноты данных по НСЕ и ЛДГ использовали множественную импутацию методом последовательных условных моделей (Fully Conditional Specification), что позволило уменьшить возможное смещение оценок и сохранить объем выборки по сравнению с анализом только полных случаев. Потерь из наблюдения не было: исход заболевания был установлен для всех пациентов на дату отсечения данных.

В модель импутации включали диагноз (НБ/контроль), уровни С18-липоформы GD2, НСЕ и ЛДГ, а также возраст; диагноз и возраст не импутировались и использовались только в качестве предикторов. Для каждого пациента формировали 20 импутированных наборов (m = 20), в каждом из которых отсутствующие значения НСЕ и ЛДГ восстанавливали на основе регрессионных моделей, соответствующих типу переменной. Для контроля влияния импутации на распределение и диагностическую информативность маркеров сравнивали описательные характеристики НСЕ и ЛДГ до и после импутации и выполняли ROC-анализ (Receiver Operating Characteristic) «до/после» на подвыборке пациентов с исходно доступными измерениями. Для более строгой оценки влияния множественной импутации дополнительно проводили анализ только полных случаев. На подвыборке пациентов с полными значениями НСЕ, ЛДГ и GD2 строили логистическую регрессионную модель с теми же 3 предикторами, что и в основной модели. Для сравнения с результатами на множественно импутированных данных сопоставляли коэффициенты: отношения шансов, 95% доверительные интервалы (ДИ) и площади под ROC-кривыми на полных и множественно импутированных наборах данных.

Логистическая регрессионная модель

Все предикторы (С18-липоформа GD2, НСЕ и ЛДГ) рассматривали как непрерывные и использовали в модели в исходном виде, в тех же единицах, в которых они измерялись в лабораториях (С18-липоформа GD2 – в нМ, НСЕ – в нг/мл, ЛДГ – в Ед/л). Предварительная категоризация, логарифмическое преобразование, центровка или стандартизация не применялись. Для моделирования вероятности наличия НБ выполняли бинарную логистическую регрессию с зависимой переменной «диагноз» (контроль/НБ). Процедуры автоматического отбора предикторов (stepwise, backward и т. п.) не использовали: все 3 маркера оставались в финальной модели независимо от статистической значимости исходя из их клинико-биологической обоснованности и текущего рутинного применения в предоперационной диагностике НБ. С учетом множественной импутации логистическую модель оценивали отдельно на каждом из 20 импутированных наборов с одинаковой спецификацией. Для каждого коэффициента в каждой импутации получали оценку и стандартную ошибку, после чего объединяли коэффициенты по правилам Рубина: вычисляли среднее значение коэффициента, среднюю внутриимпутационную дисперсию (среднее значение SE²), межимпутационную дисперсию и итоговую дисперсию с расчетом объединенной стандартной ошибки. На основе объединенных (pooled) коэффициентов записывали окончательную логистическую формулу, использовавшуюся как итоговое решающее правило.

Нейросетевая модель (многослойный персептрон)

В качестве альтернативы была построена нейросетевая модель типа многослойного персептрона с теми же предикторами. Архитектура модели включала 3 входных нейрона (НСЕ, ЛДГ и С18-липоформа GD2), 1 скрытый слой из 2 нейронов и 1 выходной нейрон с логистической функцией активации, формирующей прогноз вероятности наличия НБ. Перед обучением нейросетевой модели предикторы стандартизовали (вычитание среднего и деление на стандартное отклонение, рассчитанные по данным 6-й импутации). Модель обучали на полной 6-й импутированной выборке без дополнительного разбиения на обучающую и тестовую подвыборки. Полученная таким образом модель рассматривалась как нейросетевое решающее правило и далее применялась ко всем 20 импутированным наборам данных для расчета предсказанных вероятностей.

Внутренняя валидация моделей

Внутренняя валидация логистической и нейросетевой моделей осуществлялась посредством строгой 5-fold кросс-валидации отдельно для каждого из 20 импутированных наборов данных. На уровне идентификатора задавали одинаковый во всех импутациях номер фолда (1–5). В рамках каждой импутации модель последовательно обучали на 4/5 фолдов (обучающая подвыборка), после чего по предсказанным вероятностям на оставшемся фолде рассчитывали AUC (Area Under the Curve) (валидационная подвыборка). Процедуру повторяли для всех 5 фолдов, после чего для каждой импутации рассчитывали среднее значение AUC по фолдам, а затем усредняли их по всем 20 импутированным наборам данных с фиксацией диапазона средних AUC. По результатам внутренней валидации структура моделей и значения коэффициентов не изменялись, дополнительная перекалибровка не выполнялась. Внешняя валидация не проводилась (разработка и внутренняя валидация выполнялись на одной и той же выборке).

Выбор и оценка качества финальной модели

Основным показателем качества моделей служили их дискриминационная способность, оцениваемая по AUC с 95% ДИ, чувствительность, специфичность, а также положительная (positive predictive value, PPV) и отрицательная (negative predictive value, NPV) прогностические ценности при выбранном пороговом значении вероятности, определяемого по индексу Юдена. Дополнительно оценивали PPV и NPV с учетом предполагаемой распространенности (преваленса) события в популяции [18]. Для логистического и нейросетевого решающего правил AUC рассчитывали на полной множественно импутированной выборке (m = 20). Сравнение проводили как по значениям AUC, так и по структуре важности предикторов, а также с учетом результатов строгой 5-fold кросс-валидации обеих моделей. Для выбора финального решающего правила дополнительно применяли тест DeLong для оценки разности AUC на объединенной выборке.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика пациентов

В анализ были включены пациенты, которые имели идентифицированные до начала специфической терапии/хирургического лечения концентрации циркулирующей С18-липоформы GD2 в крови. Анализируемая подгруппа включала 155 пациентов, при этом доля пациентов с диагнозом НБ составила 57,4% (n = 89); пациенты с ганглионейромой (8,4%; n = 13) и другими заболеваниями (34,2%; n = 53) сформировали контрольную группу и подлежали анализу без исключений (рисунок 1). Поскольку ганглионейрома является зрелой нейрогенной опухолью и представляет собой одно из основных «диагностических конкурирующих состояний» у пациентов с подозрением на НБ, в настоящем анализе она была отнесена к контрольной группе.

 

Рисунок 1

Блок схема включения и отбора пациентов

Figure 1

Flowchart of patient inclusion and selection

NSE – neuron-specific enolase; LDH – lactate dehydrogenase

 

Медиана возраста на момент установления диагноза в анализируемой группе пациентов (НБ и контрольная группа) составила 15,9 мес (межквартильный размах (interquartile range, IQR) – 3,4–65,9; разброс – 0,0–210,0). Соотношение мальчиков (55,5%; n = 86) и девочек (44,5%; n = 69) – 1,24:1. Демографические, клинические и биологические характеристики включенных пациентов с НБ (n = 89) и контрольной группы (n = 66) представлены в таблицах 1, 2.

 

Таблица 1

Характеристика пациентов с установленным диагнозом НБ

Table 1

Characteristics of patients with a confirmed neuroblastoma (NB) diagnosis

Параметр Parameter	Значение Value
1	2
Всего, n Total, n	89
Возраст на момент установления диагноза, Ме (IQR), месяцы Age at diagnosis, Ме (IQR), months	6,68 (3,3–37,0)
Пол: Sex: мальчики, n (%) male, n (%) девочки, n (%) female, n (%) соотношение ratio	49 (55,1) 40 (44,9) 1,22:1
Локализация первичной опухоли, n (%): Primary tumor site, n (%): заднее средостение mediastinum забрюшинное пространство retroperitoneum надпочечник adrenal gland малый таз pelvic более одной анатомической локализации multiple primary tumor без первичного очага without primary tumor	14 (15,7) 23 (25,8) 49 (55,1) 1 (1,1) 1 (1,1) 1 (1,1)
Гистологический тип, n (%): Histological type, n (%): недифференцированная НБ undifferentiated NB низкодифференцированная НБ poorly differentiated NB дифференцирующаяся НБ differentiating NB узловой тип ганглионейробластомы ganglioneuroblastoma (nodular type) смешанная ганглионейробластома ganglioneuroblastoma (intermixed type) НБ с неустановленным гистологическим подтипом NB NOS первичное гистологическое исследование не проводилось* not investigated*	5 (5,6) 61 (68,5) 6 (6,7) 1 (1,1) 12 (13,5) 2 (2,2) 2 (2,2)
Cтадия по INSS, n (%): INSS stage, n (%): 1 2 3 4 4S	25 (28,1) 28 (31,5) 8 (9,0) 17 (19,1) 11 (12,4)
1	2
Cтадия по INRGSS n (%): INRGSS stage, n (%): L1 L2 M MS	24 (27,0) 37 (41,6) 16 (18,0) 12 (13,5)
MYCN, n (%): амплификация amplified отсутствие амплификации non-amplified gain исследование не проводилось not investigated	7 (7,9) 74 (83,1) 6 (6,7) 2 (2,2)
1р, n (%): делеция или дисбаланс deletion or imbalance отсутствие делеции normal исследование не проводилось not investigated	14 (15,7) 73 (82,0) 2 (2,2)
11q, n (%): делеция deletion отсутствие делеции или дисбаланс normal or imbalance исследование не проводилось not investigated	5 (5,6) 79 (88,7) 5 (5,6)
Группа риска, n (%): Risk group, n (%): низкий (наблюдение) low (watch and wait) промежуточный intermediate высокий high	69 (77,5) 6 (6,7) 14 (15,7)

Примечание. ^* – первичный диагноз был установлен на основании выявления опухолевых клеток в костном мозге в соответствии с международными критериями диагностики НБ [15] и впоследствии подтвержден при повторной (second-look) операции.

Note. ^* – the primary diagnosis was established based on the presence of tumor cells in the bone marrow in accordance with the international criteria for NB diagnosis [15] and was subsequently confirmed during the second-look surgery. INSS – International Neuroblastoma Staging System; INGRSS – International Neuroblastoma Risk Group Staging System; NOS – not otherwise specified; IQR – interquartile range.

 

Таблица 2

Характеристика пациентов контрольной группы

Table 2

Characteristics of patients in the control group

Параметр Parameter	Значение Value
Всего, n Total, n	66
Возраст на момент установления диагноза, Ме (IQR), месяцы Age at diagnosis, Ме (IQR), months	56,6 (6,7–104,6)
Пол: Sex: мальчики, n (%) male, n (%) девочки, n (%) female, n (%) соотношение ratio	37 (56,1) 29 (43,9) 1,27:1
Локализация первичной опухоли, n (%): Primary tumor site, n (%): область шеи neck заднее средостение mediastinum забрюшинное пространство retroperitoneum надпочечник adrenal gland малый таз pelvic более одной анатомической локализации multiple primary tumor почка kidney печень liver другие локализации other	1 (1,5) 8 (12,1) 11 (16,7) 15 (22,7) 5 (7,6) 2 (3,0) 14 (21,2) 3 (4,5) 7 (10,6)
Гистологический тип, n (%) Histological type, n (%)
Опухолевые заболевания: Tumor diseases: адренокортикальная карцинома adrenocortical carcinoma воспалительная миофибробластическая опухоль inflammatory myofibroblastic tumor ганглионейрома ganglioneuroma гепатобластома hepatoblastoma гемангиома hemangioma доброкачественные кисты benign cysts злокачественная рабдоидная опухоль malignant rhabdoid tumor мукоэпителиоидная карцинома mucoepidermoid carcinoma нефробластома nephroblastoma папиллярная карцинома papillary carcinoma пилоидная астроцитома pilocytis astrocytoma саркома Юинга Ewing’s sarcoma саркома мягких тканей soft tissue sarcoma тератома teratoma феохромоцитома и параганглиома pheochromocytoma/paraganglioma эстезионейробластома esthesioneuroblastoma шваннома schwannoma	1 (1,5) 1 (1,5) 13 (19,7) 1 (1,5) 1 (1,5) 6 (9,1) 3 (4,5) 1 (1,5) 12 (18,2) 1 (1,5) 1 (1,5) 2 (3,0) 5 (7,6) 4 (6,1) 4 (6,1) 1 (1,5) 1 (1,5)
Неопухолевые заболевания: Non-tumor diseases: гематома hematoma гетеротопия heterotopia лимфоидная гиперплазия lymphoid hyperplasia гранулематозное воспаление granulomatous inflammation пульмональная секвестрация pulmonary sequestration	2 (3,0) 2 (3,0) 1 (1,5) 1 (1,5) 2 (3,0)

 

В группе пациентов с установленным диагнозом НБ (n = 89) было установлено долевое преобладание мальчиков (55,1%; n = 49) над девочками (44,9%; n = 40) в соотношении 1,22:1. Медиана возраста на момент установления диагноза составила 6,68 мес (IQR – 3,3–37,0; разброс – 0,0–209,0). Среди гистологических вариантов нейрогенных опухолей наибольшей частоты достигал низкодифференцированный подтип НБ (68,5%; n = 61); смешанная ганглионейробластома (13,5%; n = 12), дифференцирующаяся НБ (6,7%; n = 6), недифференцированная НБ (5,6%; n = 5) и нейробластома без дополнительного уточнения (2,2%; n = 2) были представлены реже, при этом у 2,2% пациентов (n = 2) гистологическое исследование не проводилось, а у 1,1% (n = 1) был зарегистрирован редкий узловой подтип ганглионейробластомы.

Адренальная локализация первичных образований (55,1%; n = 49) значимо доминировала над опухолями, локализованными в забрюшинном пространстве (25,8%; n = 23), заднем средостении (15,7%; n = 14) и малом тазу (1,1%; n = 1), при этом у 1,1% (n = 1) была установлена первично-множественная форма заболевания, и у 1,1% (n = 1) первичная опухоль выявлена не была (пациент имел интраспинальное (эпидуральное) образование на уровне Th11–L2 и был отнесен к категории «без первичного очага»).

Локализованные стадии НБ по INSS – 1 (28,1%; n = 25), 2 (31,5%; n = 28) и 3 (9,0%; n = 8) были представлены удельно чаще, чем стадия 4 (19,1%; n = 17), при этом у 12,4% (n = 11) была установлена «специальная» 4S стадия.

Распределение в рамках предоперационной системы стратификации INRGSS также продемонстрировало дискретное превалирование локализованных стадий – L1 (27,0%; n = 24), L2 (41,6%; n = 37) над стадиями с наличием отдаленных метастазов – М (18%; n = 16) и MS (13,5%; n = 12).

Аберрации гена MYCN были представлены амплификацией (7,9%; n = 7) и gain (6,7%; n = 6); у 83,1% (n = 74) пациентов было подтверждено отсутствие амплификации, при этом у 2,2% (n = 2) статус гена MYCN установлен не был. Делеции или дисбаланс локуса 1р идентифицированы у 15,7% пациентов (n = 14), при этом у 82,0% (n = 73) аберраций найдено не было, а у 2,2% (n = 2) исследование не проводилось. При исследовании статуса локуса 11q делеция была выявлена у 5,6% пациентов (n = 5), отсутствие делеции или дисбаланс – у 88,7% (n = 79), у 5,6% (n = 5) исследование статуса локуса 11q не проводилось.

Таким образом, при комплексной оценке возраста на момент установления диагноза стадии заболевания по INSS и статуса гена MYCN и локуса 1р 77,5% (n = 69) пациентов были стратифицированы в группу наблюдения, 6,7% (n = 6) – в группу промежуточного риска, 15,7% (n = 14) – в группу высокого риска (таблица 1).

Контрольная группа соотносительно с группой пациентов с НБ характеризовалась схожим гендерным распределением: мальчики (56,1%; n = 37) превалировали над девочками (43,9%; n = 29) в соотношении 1,27:1, при этом группа контроля на момент установления диагноза была несколько старше: расчетная медиана возраста составила 56,6 месяца (IQR – 6,7–104,6; разброс – 0,0–210,0). Адренальная локализация первичных образований (22,7%; n = 15) также превалировала над образованиями, локализованными в забрюшинном пространстве внеорганно (16,7%; n = 11), заднем средостении (12,1%; n = 8) и малом тазу (7,6%; n = 5). В 1,5% (n = 1) первичная опухоль была локализована в области шеи, у 3,0% (n = 2) была установлена первично-множественная форма заболевания, оставшаяся часть пациентов имела другие органоспецифические локализации, в том числе ренальную (21,2%; n = 14), печеночную (4,5%; n = 3) и другие более редкие локализации (10,6%; n = 7) (таблица 2).

Импутация пропущенных значений

Для НСЕ и ЛДГ отмечалась значительная доля пропусков в обеих группах: у 19/155 (12,3%) пациентов для НСЕ и у 59/155 (38,1%) – для ЛДГ. Для восстановления пропусков значений НСЕ и ЛДГ была выполнена множественная импутация с формированием 20 импутированных наборов данных (m = 20). После импутации распределения НСЕ и ЛДГ оставались сопоставимыми с исходно измеренными значениями: центральные тенденции и разброс оставались близки к исходным данным.

Площади под ROC-кривыми (AUC) для НСЕ составили 0,689 ± 0,046 (95% ДИ 0,599–0,780; p < 0,001) против 0,658 ± 0,010 (95% ДИ 0,640–0,678; p < 0,001), тогда как для ЛДГ – 0,721 ± 0,069 (95% ДИ 0,585–0,857; p = 0,007) и 0,566 ± 0,012 (95% ДИ 0,544–0,589; p < 0,001) для исходных и импутированных наборов данных соответственно. Для импутированных значений ЛДГ AUC стала ближе к ожидаемо ограниченной дискриминационной способности этого показателя, оставаясь тем не менее выше 0,5. Более высокая AUC по исходным данным, вероятно, в значительной степени отражала особенности выборки, а не истинную диагностическую информативность. Таким образом, поскольку после процедуры импутации дискриминационные характеристики по ROC- анализу существенно не изменились, это позволило использовать множественно импутированные данные для последующего построения моделей и сравнения диагностической информативности отдельных маркеров и их комбинаций (рисунок 2).

 

Рисунок 2

Сравнение ROC-кривых для исходных и множественно импутированных данных (m = 20)

Красные кривые – НСЕ по исходным (с пустыми маркерами; AUC = 0,689) и импутированным (сплошная; AUC = 0,658) данным. Синие кривые – ЛДГ по исходным (с пустыми маркерами; AUC = 0,721) и импутированным (сплошная; AUC = 0,566) данным. Серая пунктирная прямая – диагональная опорная линия отсутствия дискриминации

Figure 2

Comparison of ROC curves for original and multiply imputed data (m = 20)

Red curves – NSE based on original (with hollow markers; AUC = 0.689) and imputed (solid; AUC = 0.658) data. Blue curves – LDH based on original (with hollow markers; AUC = 0.721) and imputed (solid; AUC = 0.566) data. Grey dashed line – diagonal reference line of no discrimination

 

Логистическая регрессионная модель

В логистическую регрессионную модель были включены С18-липоформа GD2 (маркер жидкостной биопсии) и сывороточные опухолевые маркеры НСЕ и ЛДГ. Для учета множественной импутации модель оценивалась дискретно на каждом из 20 импутированных наборов данных, после чего коэффициенты объединялись по правилам Рубина. В объединенных (pooled) оценках только С18-липоформа GD2 продемонстрировала статистически значимую ассоциацию с наличием НБ: регрессионный коэффициент (β) = 0,070 ± 0,017; отношение шансов (ОШ) = 1,07; 95% ДИ 1,04–1,11; p < 0,001). Коэффициенты для НСЕ и ЛДГ были малы по модулю и статистически незначимы (для НСЕ: β = –0,002 ± 0,998; 95% ДИ 0,992–1,004; для ЛДГ: β = –0,001 ± 0,999; 95% ДИ 0,997–1,002) (таблица 3).

 

Таблица 3

Финальные коэффициенты логистической регрессионной модели (объединенные по Рубину на 20 импутированных наборах данных)

Table 3

Final coefficients of the logistic regression model (pooled according to Rubin`s rules across 20 imputed datasets)

Предикторы Predictors	β	Стандартная ошибка Standard error	ОШ OR	95% ДИ для ОШ 95% СI for OR
Константа Constant	–0,776	0,389	–	–
НСЕ NSE	–0,002	0,003	0,998	0,992–1,004
ЛДГ LDH	–0,001	0,001	0,999	0,997–1,002
С18 GD2	0,070	0,017	1,07	1,04–1,11

Примечание. С18 GD2 – С18-липоформа GD2.

Note. C18 GD2 – C18 lipoform of GD2; b – regression coefficient; OR – odds ratio; CI – confidence interval.

 

На основе объединенных (pooled) коэффициентов логистической регрессии было сформулировано итоговое решающее правило в виде логит модели, позволяющей вычислять индивидуальную вероятность диагностики НБ:

p = 1/ (1 + e^–Z), Z = –0,002 × НСЕ (нг/мл) –

0,001 × ЛДГ (Ед/л) + 0,07 × GD2 (нМ) – 0,776,

где p – вероятность наличия у пациента НБ.

Решающее правило логит-модели было применено для предсказания вероятности наличия НБ на объединенных множественно импутированных данных. Площадь под ROC кривой для решающего правила составила 0,842 ± 0,007; 95% ДИ 0,829–0,856, что соответствует хорошей дискриминационной способности. Для отдельных маркеров значения AUC составляли 0,837 ± 0,007; 95% ДИ 0,823–0,850 для С18-липоформы GD2; 0,658 ± 0,010; 95% ДИ 0,638–0,677 для НСЕ и 0,566 ± 0,012; 95% ДИ 0,544–0,589 для ЛДГ, что подчеркивает доминирующий вклад С18-липоформы GD2 и ограниченную диагностическую информативность НСЕ и ЛДГ по отдельности (рисунок 3).

 

Рисунок 3

Сравнение ROC-кривых логистической регрессионной модели и отдельных предикторов на объединенной множественно импутированной выборке (m = 20)

Зеленая кривая – логистическое решающее правило (AUC = 0,842); оранжевая кривая – С18-липоформа GD2 (AUC = 0,837); красная кривая – НСЕ (AUC = 0,658); синяя кривая – ЛДГ (AUC = 0,566); серая пунктирная прямая – диагональная опорная линия отсутствия дискриминации

Figure 3

Comparison of ROC curves for the logistic regression model and individual predictors on the pooled multiply imputed dataset (m = 20)

Green curve – logistic decision rule (AUC = 0.842); orange curve – C18 lipoform GD2 (AUC = 0.837); red curve – NSE (AUC = 0.658); blue curve – LDH (AUC = 0.566); grey dashed line – diagonal reference line of no discrimination

 

На подвыборке пациентов с полными значениями НСЕ, ЛДГ и циркулирующей липоформой GD2 (n = 95) логистическая регрессионная модель с 3 предикторами для С18-липоформы GD2 показала увеличение ОШ = 1,12 (95% ДИ 1,03–1,21), тогда как в объединенной множественно импутированной модели ОШ = 1,07 (95% ДИ 1,04–1,11). Коэффициенты для НСЕ (ОШ = 1,01; 95% ДИ 0,98–1,05) и ЛДГ (ОШ = 1,00; 95% ДИ 0,99–1,01) в обоих анализах оставались статистически незначимыми. Дискриминационная способность логистической модели на полных случаях также была сопоставима с моделью на множественно импутированной выборке: AUC = 0,903 (95% ДИ 0,840–0,966) против 0,842 (95% ДИ 0,829–0,856). Это не свидетельствует о выраженных изменениях ключевых ассоциаций и дискриминационной способности модели после импутации.

Для ЛДГ после множественной импутации отмечено снижение AUC с 0,721 до 0,566, что, вероятно, отражает селекцию подвыборки с исходно измеренным ЛДГ и требует осторожной интерпретации роли ЛДГ как одиночного маркера. При этом в многопараметрической логистической модели ЛДГ в обоих анализах оставался статистически незначимым предиктором с минимальным вкладом по сравнению с С18-липоформой GD2.

Строгая 5-fold кросс-валидация логистической регрессионной модели

Внутреннюю устойчивость логистической регрессионной модели оценивали посредством применения строгой 5-fold кросс-валидации, выполняемой отдельно на каждом из 20 импутированных наборов данных. Для каждого набора пациенты случайным образом распределялись по 5 фолдам на уровне идентификатора, на каждом шаге модель обучали на 4 фолдах и оценивали AUC на оставшемся. Средние значения AUC по 5 фолдам в отдельных импутациях варьировали от 0,811 до 0,867, а интегральное среднее по всем 20 импутированным наборам составило 0,838. Эти значения были сопоставимы с AUC модели, рассчитанной на полной импутированной выборке (0,842), что свидетельствует об устойчивой дискриминационной способности модели при повторных разбиениях выборки и с учетом неопределенности, связанной с множественной импутацией (таблица 4).

 

Таблица 4

Результаты строгой 5-fold кросс-валидации логистической регрессионной модели на 20 импутированных наборах данных

Table 4

Results of strict 5-fold cross-validation of the logistic regression model on 20 imputed datasets

Импутация Imputation	AUC 1-го фолда AUC, fold 1	AUC 2-го фолда AUC, fold 2	AUC 3-го фолда AUC, fold 3	AUC 4-го фолда AUC, fold 4	AUC 5-го фолда AUC, fold 5	AUC, среднее значение Mean AUC
1	0,900	0,900	0,752	0,819	0,808	0,836
2	0,871	0,929	0,791	0,792	0,778	0,832
3	0,910	0,956	0,769	0,826	0,765	0,845
4	0,895	0,888	0,791	0,838	0,769	0,836
5	0,890	0,896	0,756	0,788	0,731	0,812
6	0,900	0,892	0,795	0,819	0,782	0,838
7	0,881	0,904	0,731	0,811	0,726	0,811
8	0,938	0,904	0,778	0,838	0,816	0,855
9	0,905	0,921	0,791	0,895	0,795	0,861
10	0,876	0,888	0,786	0,765	0,765	0,816
11	0,805	0,925	0,761	0,874	0,765	0,826
12	0,929	0,913	0,791	0,891	0,752	0,855
13	0,924	0,908	0,821	0,807	0,765	0,845
14	0,910	0,904	0,825	0,807	0,786	0,846
15	0,900	0,904	0,752	0,830	0,756	0,828
16	0,924	0,913	0,697	0,874	0,761	0,834
17	0,890	0,921	0,718	0,792	0,744	0,813
18	0,933	0,913	0,765	0,899	0,791	0,860
19	0,890	0,950	0,769	0,796	0,769	0,835
20	0,910	0,904	0,803	0,878	0,838	0,867
Общее среднее значение AUC Overall mean AUC						0,838

 

Нейросетевая модель (многослойный персептрон)

Для сравнения с логистической регрессионной моделью была построена нейросетевая модель типа многослойного персептрона с 3 входами (С18-липоформа GD2, НСЕ и ЛДГ), 1 скрытым слоем из 2 нейронов и 1 выходным нейроном с логистической функцией активации, формирующей прогноз вероятности наличия НБ.

Визуальный анализ структуры нейросетевой модели (рисунок 4) показал, что наиболее выраженные по модулю веса приходятся на связи, идущие от С18-липоформы GD2 к нейронам скрытого слоя и далее от скрытых нейронов к выходному нейрону O1. Связи, соответствующие НСЕ и ЛДГ, имели меньшую величину весов. Количественный анализ относительной важности входов (метод Гарсона) подтвердил доминирующий вклад С18-липоформы GD2 (относительная важность – 0,884) по сравнению с НСЕ (0,125) и практически малым вкладом ЛДГ (0,067).

 

Рисунок 4

Архитектура нейросетевой модели: 3 входных нейрона (l1 – НСЕ; l2 – ЛДГ; l3 – С18-липоформа GD2), 1 скрытый слой из 2 нейронов (H1–H2) со смещением (B1) и 1 выходной нейрон (O1) со смещением (В2). Толщина и оттенок линий отражают величину весов связей между нейронами

Figure 4

Architecture of the neural network model: three input neurons (l1 – NSE, l2 – LDH, l3 – C18 lipoform GD2), 1 hidden layer with 2 neurons (H1–H2) and a bias unit (B1), and 1 output neuron (O1) with a bias unit (B2). The thickness and shade of the lines reflect the magnitude of the connection weights between neurons

 

По предсказанным вероятностям нейросетевой модели, рассчитанным на 6-й импутированной выборке, была построена ROC-кривая. AUC для нейросетевого решающего правила составила 0,836 ± 0,031 (95% ДИ 0,775–0,897), что также свидетельствует о хорошей дискриминационной способности модели (рисунок 5).

 

Рисунок 5

ROC-кривая решающего правила нейросетевой модели (AUC = 0,836; импутация 6)

Красная кривая – решающее правило нейросети; серая пунктирная прямая – диагональная опорная линия отсутствия дискриминации

Figure 5

ROC curve of the neural network model (AUC = 0.836; imputation 6)

Red curve – neural network decision rule, grey dashed line – diagonal reference line of no discrimination

 

Строгая 5-fold кросс-валидация нейросетевой модели

По аналогии с логистической моделью внутренняя устойчивость нейросетевой модели оценивалась посредством строгой 5-fold кросс-валидации на каждом из 20 наборов импутированных данных. Средние значения AUC по 5 фолдам в отдельных импутациях варьировали от 0,684 до 0,841, при этом интегральное среднее по всем 20 импутированным наборам составило 0,759, что указывало на хорошую, но менее стабильную дискриминационную способность многослойного персептрона по сравнению с логистический регрессионной моделью (таблица 5).

 

Таблица 5

Результаты строгой 5-fold кросс-валидации нейросетевой модели на 20 импутированных наборах данных

Table 5

Results of strict 5-fold cross-validation of the neural network model on 20 imputed datasets

Импутация Imputation	AUC 1-го фолда AUC, fold 1	AUC 2-го фолда AUC, fold 2	AUC 3-го фолда AUC, fold 3	AUC 4-го фолда AUC, fold 4	AUC 5-го фолда AUC, fold 5	AUC, Среднее значение Mean AUC
1	0,793	0,933	0,769	0,782	0,791	0,814
2	0,674	0,625	0,795	0,767	0,769	0,726
3	0,700	0,594	0,769	0,716	0,778	0,711
4	0,824	0,594	0,784	0,794	0,842	0,768
5	0,650	0,625	0,577	0,838	0,904	0,719
6	0,752	0,906	0,684	0,685	0,615	0,729
7	0,781	0,840	0,714	0,588	0,684	0,721
8	0,862	0,865	0,810	0,807	0,861	0,841
9	0,812	0,896	0,744	0,691	0,662	0,761
10	0,700	0,904	0,848	0,714	0,673	0,768
11	0,855	0,531	0,829	0,857	0,645	0,744
12	0,900	0,765	0,769	0,691	0,778	0,781
13	0,550	0,594	0,827	0,727	0,722	0,684
14	0,750	0,804	0,814	0,714	0,744	0,765
15	0,907	0,954	0,750	0,714	0,701	0,805
16	0,752	0,835	0,780	0,536	0,774	0,735
17	0,905	0,662	0,882	0,723	0,850	0,805
18	0,821	0,635	0,667	0,731	0,855	0,742
19	0,800	0,917	0,829	0,819	0,669	0,807
20	0,679	0,904	0,684	0,811	0,786	0,773
Общее среднее значение AUC Overall mean AUC						0,759

 

Выбор итоговой модели

По результатам исследования были протестированы как классический, так и более сложный алгоритмы классификации: логистическая регрессионная модель и нейросетевая модель (многослойный персептрон).

Логистическая регрессионная модель, основанная на дискретно полученных в каждом из 20 импутированных наборов данных коэффициентах, объединенных по правилам Рубина, позволяла моделировать вероятность наличия НБ посредством анализа С18-липоформы GD2 (маркера жидкостной биопсии) и сывороточных опухолевых маркеров НСЕ и ЛДГ, продемонстрировав хорошую дискриминационную способность (AUC 0,842 ± 0,007; 95% ДИ 0,829–0,856).

Одновременно с этим была построена нейросетевая модель с теми же предикторами (многослойный персептрон). На полной 6-й импутированной выборке нейросетевое решающее правило продемонстрировало сопоставимую с логистической моделью дискриминационную способность (AUC 0,836 ± 0,031; 95% ДИ 0,779–0,900). При применении обоих решающих правил ко всем 20 импутированным наборам данных площади под ROC-кривыми продемонстрировали практически идентичные показатели: 0,842 ± 0,007; 95% ДИ 0,829–0,856 против 0,841 ± 0,006; 95% ДИ 0,828–0,855 для логистической и нейросетевой моделей соответственно, при этом по тесту DeLong статистически значимых различий между моделями выявлено не было (p = 0,904) (рисунок 6).

 

Рисунок 6

Сравнение ROC-кривых логистического и нейросетевого решающих правил на объединенной множественно импутированной выборке (m = 20)

Красная кривая – логистическое решающее правило (AUC = 0,842); синяя кривая – нейросетевое решающее правило (AUC = 0,841); серая пунктирная прямая – диагональная опорная линия отсутствия дискриминации; по тесту DeLong статистически значимых различий между AUC моделей не выявлено (p = 0,904)

Figure 6

Comparison of ROC curves for the logistic and neural network decision rules on the pooled multiply imputed dataset (m = 20)

The red curve represents the logistic decision rule (AUC = 0.842), the blue curve represents the neural network decision rule (AUC = 0.841), and the grey dashed line indicates the diagonal reference line of no discrimination; according to DeLong’s test, no statistically significant difference between the AUCs of the models was found (p = 0.904)

 

При выборе порогового значения вероятности по индексу Юдена логистическое решающее правило обеспечивало чувствительность 0,638 (95% ДИ 0,615–0,661) и специфичность 0,945 (95% ДИ 0,931–0,956); PPV и NPV составляли 0,940 (95% ДИ 0,925–0,952) и 0,660 (95% ДИ 0,638–0,681) соответственно. Нейросетевое решающее правило демонстрировало сопоставимые показатели: чувствительность – 0,636 (95% ДИ 0,613–0,658), специфичность – 0,948 (95% ДИ 0,935–0,960), PPV – 0,943 (95% ДИ 0,929–0,956), NPV – 0,659 (95% ДИ 0,637–0,680), что вместе с сопоставимыми значениями AUC не свидетельствовало о каком-либо клинически значимом преимуществе нейросетевой модели по сравнению с логистической регрессией. Приведенные значения PPV и NPV относятся к «обогащенной» диагностической когорте (превалентность НБ ≈57%). При сохранении чувствительности и специфичности расчетные прогностические значения заметно изменяются при иной доле НБ среди обследованных пациентов. Так, при гипотетической превалентности 7% (порядка доли НБ среди всех злокачественных новообразований у детей [18]) ожидаемые PPV и NPV для логистического решающего правила составляют 0,466 и 0,972 соответственно, тогда как для нейросетевого решающего правила – 0,479 и 0,973 соответственно.

Анализ относительной важности входов в нейросетевой модели (метод Гарсона) показал доминирующий вклад С18-липоформы GD2 (относительная важность 0,884), тогда как вклад НСЕ был умеренным (0,125), а вклад ЛДГ – минимальным (0,067). Это полностью согласуется с результатами логистической регрессии и ROC-анализа, где именно С18-липоформа GD2 являлась основным информативным предиктором, а НСЕ и ЛДГ по отдельности давали ограниченный вклад.

Вместе с тем строгая 5-fold кросс-валидация, выполнявшаяся отдельно на каждом из 20 импутированных наборов данных, продемонстрировала более стабильную работу логистической модели: среднее значение AUC логистического решающего правила составило 0,838 (0,811–0,867), тогда как для нейросетевой модели – 0,759 с более выраженной вариабельностью между импутациями (от 0,684 до 0,841).

Таким образом, с учетом сопоставимого значения AUC на объединенных данных, отсутствия статистически значимых различий между правилами по тесту DeLong, большей устойчивости и значительно лучшей интерпретируемости логистическая регрессионная модель была выбрана в качестве финального решающего правила для неинвазивной диагностики НБ.

На основе полученной формулы реализован онлайн калькулятор для расчета индивидуальной вероятности диагностики НБ по концентрациям НСЕ, ЛДГ и С18-липоформы GD2 (liquidbiopsy.ru), что облегчает практическое применение разработанного решающего правила в клинической работе. Так, у пациента 3 месяцев с локализованной низкодифференцированной НБ надпочечника (GD2 = 110 нМ, НСЕ = 43 нг/мл, ЛДГ = 291 Ед/л) предсказанная вероятность НБ по модели составила 99,9%; у пациента 8 лет с ганглионейромой надпочечника (GD2 = 15 нМ, НСЕ = 24 нг/мл, ЛДГ = 202 Ед/л) – 50%.

Ограничения исследования

Наше исследование имеет несколько ограничений, которые следует учитывать при интерпретации результатов. Во-первых, выборка пациентов была относительно небольшой и одноцентровой, что может ограничивать перенос результатов на другие популяции пациентов. Во-вторых, относительно маркеров НСЕ и ЛДГ была отмечена значительная доля пропущенных значений и, хотя пропуски обрабатывались с помощью множественной импутации, исход (диагноз НБ/контроль) включался в модель импутации в качестве предиктора, что теоретически могло способствовать небольшой утечке информации (information leakage), остается вероятность остаточного смещения, связанного с механизмом пропусков, который не мог быть полностью проверен. В-третьих, число событий на предиктор было ограниченным, что могло способствовать нестабильности оценок для НСЕ и ЛДГ и частично объяснять отсутствие их статистической значимости в финальной модели. Несмотря на то, что коэффициенты НСЕ и ЛДГ обеспечивали минимальный прирост AUC по сравнению с одиночным GD2, мы сохранили сывороточные маркеры в финальной модели, поскольку они широко используются в текущей клинической практике при НБ и потенциально отражают иные аспекты биологии опухоли, и, вероятно, имеют большую ценность в динамическом мониторинге и прогнозе, чем в первичной диагностике. В-четвертых, разработка и внутренняя валидация модели проводились в одном центре на одной и той же когорте пациентов, поэтому необходима проверка модели на других выборках. Наконец, в нашей когорте не наблюдалось выраженного дисбаланса классов (57,4% пациентов с НБ и 42,6% – контрольная группа), однако при ином соотношении НБ/контроль в клинической практике, несмотря на относительную устойчивость AUC к изменению базовой частоты исхода, значения прогностических ценностей (PPV и NPV) могут отличаться от полученных в данном исследовании. В связи с этим PPV и NPV дополнительно оценивались с учетом теоретически заданной распространенности (преваленса) НБ в целевой популяции, что позволяет частично экстраполировать результаты на иные клинические сценарии.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

При всех вышеуказанных ограничениях логистическая регрессионная модель неинвазивной диагностики НБ на основе сочетания С18-липоформы GD2 (маркера жидкостной биопсии) и сывороточных опухолевых маркеров НСЕ и ЛДГ в нашей работе продемонстрировала стабильную диагностическую эффективность. AUC итоговой модели на объединенных множественно импутированных данных составила 0,842 (95% ДИ 0,829–0,856), что соответствует хорошей дискриминационной способности. Строгая 5-fold кросс-валидация, выполненная отдельно на каждом из 20 импутированных наборов данных, продемонстрировала сопоставимые результаты: среднее значение AUC по импутациям составил 0,838, а диапазон средних значений по импутациям – 0,811–0,867, что не указывает на выраженное переобучение модели.

Нейросетевая модель с теми же предикторами, обученная на 6-й импутированной выборке и затем примененная ко всем 20 импутациям, продемонстрировала близкую AUC – 0,841 (95% ДИ: 0,828-0,855) и среднее значение AUC – 0,759 по результатам строгой 5-fold кросс-валидации, т. е. не обеспечила принципиального выигрыша в дискриминации и была менее стабильна при повторных разбиениях и различных реализациях импутаций. При этом оценки нормализованной важности входов в нейросетевой модели (относительная важность С18-липоформы GD2 – 0,884, НСЕ – 0,125, ЛДГ – 0,067) и структура ее весов подтверждали превалирующий вклад С18-липоформы GD2 и ограниченный вклад сывороточных маркеров НСЕ и ЛДГ, что качественно совпадает с результатами логистической регрессии и ROC-анализа.

В целом полученные результаты подтверждают высокую диагностическую ценность циркулирующего GD2 как маркера жидкостной биопсии при НБ и показывают, что добавление сывороточных маркеров НСЕ и ЛДГ в многопараметрическую модель приводит к незначительному изменению дискриминационной способности по сравнению с одиночной С18-липоформой GD2. Это всецело согласуется с ранее опубликованными данными о высокой специфичности и чувствительности циркулирующей С18-липоформы GD2 [13], в то время как индивидуальная информативность НСЕ и ЛДГ ограничена. В отличие от большинства предшествующих работ, оценивавших С18-липоформу GD2 в качестве одиночного маркера в небольших ретроспективных выборках [9, 10, 13], наше исследование использует валидированную методику ВЭЖХ-МС/МС [9], множественную импутацию пропусков и внутреннюю валидацию, что позволяет рассматривать полученную логистическую модель как более формализованное и проверенное решающее правило. В то же время отсутствие внешней валидации и ограниченный объем выборки требуют осторожности при переносе результатов на другие популяции [19].

Практическая ценность разработанной модели неинвазивной диагностики НБ заключается в возможности количественной оценки вероятности предоперационной диагностики НБ у детей с подозрением на нейрогенную опухоль до получения гистологического заключения. Это особенно актуально в сложных клинических ситуациях (дети первых месяцев жизни, кистозные образования надпочечника, необходимость дифференциации опухоли и кровоизлияния), где решение о тактике (наблюдение либо оперативное вмешательство) часто принимается в условиях неопределенности [20], однако при очень низких уровнях всех маркеров, включая GD2, ее дополнительная диагностическая польза может быть снижена, в таких случаях решение следует принимать с учетом динамики, визуализации и мнения мультидисциплинарной команды.

Кроме того, опухоли почки представляют особую диагностическую проблему для детских онкологов, хирургов и лучевых терапевтов, поскольку их нередко трудно отличить от опухолей надпочечника. Сывороточные опухолевые НСЕ и ЛДГ при этом мало специфичны: их уровни могут быть повышены при различных заболеваниях, включая НБ и нефробластому. Это создает риск диагностических ошибок, задержки начала адекватной терапии и прогрессирования заболевания до более распространенных стадий, что ухудшает прогноз. В особенности это критично на этапе предоперационной дифференциальной диагностики НБ и нефробластомы, поскольку ошибочная открытая биопсия нефробластомы или ее нерадикальное удаление могут привести к повышению стадии опухолевого процесса. В случае повышения стадии до III пациенты с нефробластомой в дальнейшем будут нуждаться в проведении лучевой терапии, что в свою очередь ассоциировано с повышенным риском развития отдаленных побочных эффектов. На этом фоне поиск новых, более чувствительных и специфичных опухолевых маркеров, в том числе методов жидкостной биопсии, представляется особенно важным.

Оценка концентраций НСЕ и ЛДГ повсеместно используется для контроля эффективности терапии и в качестве прогностических маркеров неблагоприятного течения НБ [21]. Однако ни один из этих показателей не включен в современные системы стратификации риска, что во многом связано с высокой частотой ложноположительных результатов: концентрации НСЕ и ЛДГ существенно зависят как от ряда преаналитических факторов (например, гемолиза образца), так и от сопутствующих патофизиологических состояний [3]. Показано, что высокий уровень НСЕ ассоциирован с менее дифференцированным гистологическим вариантом НБ и в комбинации с возрастом дает AUC >0,85 [22], а повышение ЛДГ, как правило, отражает объем опухолевой массы и пролиферативную активность и может служить суррогатным маркером опухолевой нагрузки в динамике [23]. Тем не менее ограниченная специфичность этих сывороточных маркеров ограничивает их применение в качестве самостоятельных диагностических инструментов. На этом фоне включение высокоспецифичного маркера жидкостной биопсии (С18-липоформы GD2) в 3-маркерную модель представляется принципиальным усилением диагностического подхода.

На основе итоговой формулы логистической регрессионной модели уже реализован прототип калькулятора риска, позволяющий по значениям С18-липоформы GD2, НСЕ и ЛДГ рассчитывать индивидуальную вероятность НБ и использовать ее в качестве дополнительного аргумента при обсуждении тактики лечения в мультидисциплинарной команде. В дальнейшем модель требует внешней валидации на независимых когортах пациентов в других медицинских организациях и при необходимости – перекалибровки. Перспективными направлениями также являются изучение динамики изменения циркулирующей С18-липоформы GD2 на этапах терапии и сравнение с более сложными алгоритмами машинного обучения (на основе деревьев решений и градиентного бустинга) с включением дополнительных предикторов (например, радиологических характеристик) в многоцентровых выборках [24] или другими опухолевыми маркерами (метаболитами катехоламинов мочи).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Циркулирующая С18-липоформа GD2 является ключевым компонентом диагностической модели, тогда как НСЕ и ЛДГ вносят минимальный дополнительный вклад. Нейросетевая модель не обеспечивает существенного выигрыша по AUC и менее стабильна, чем логистическая регрессионная модель. С учетом сопоставимой дискриминационной способности, большей устойчивости и интерпретируемости в качестве финального решающего правила для неинвазивной диагностики НБ выбрана логистическая регрессионная модель, реализованная в виде онлайн-калькулятора риска [25].

ВКЛАД АВТОРОВ

Н.С. Иванов: разработка концепции рукописи, сбор и анализ данных, статистическая обработка данных, написание статьи;

М.Я. Ядгаров: статистическая проверка данных, участие в анализе полученных результатов;

Д.Ю. Качанов: руководство исследованием, научное редактирование статьи;

С.С. Ларин: руководство лабораторными исследованиями, обработка лабораторных данных;

М.Д. Моллаев: выполнение лабораторных исследований, обработка лабораторных данных;

Е.А. Литвин: анализ лабораторных показателей, интерпретация полученных результатов;

М.А. Масчан: научное руководство, научное редактирование статьи;

Н.С. Грачев: координация работы, научное редактирование статьи, утверждение окончательной версии статьи;

Т.В. Шаманская: руководство исследованием, научное редактирование статьи.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

N.S. Ivanov: manuscript conception, data collection and analysis, statistical data processing, manuscript writing;

M.Ya. Yadgarov: statistical verification of the data, participation in the analysis of results;

D.Yu. Kachanov: study supervision; scientific revision of the manuscript;

S.S. Larin: supervision of laboratory studies; processing of laboratory data;

M.D. Mollaev: carrying out laboratory studies, processing of laboratory data;

E.A. Litvin: laboratory data analysis; interpretation of the findings;

M.A. Maschan: scientific guidance; scientific revision of the manuscript;

N.S. Grachev: coordination of research activity; scientific revision of the manuscript; a final approval of the manuscript;

T.V. Shamanskaya: study supervision; scientific revision of the manuscript.

ЭТИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА

Исследование проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации: от родителей/законных представителей всех пациентов было получено письменное информированное согласие. Протокол клинического исследования был утвержден экспертным советом (протокол заседания №1/2021 от 26.03.2021) и независимым этическим комитетом (протокол №6/2021 от 15.06.2021) ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России.

ETHICS REVIEW

The study was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki: all the patients’ parents/legal representatives provided written informed consent. Clinical trial protocol was approved by the Expert Panel (Minutes of the Meeting No.1/2021 dated 26.03.2021) and the Independent Ethics Committee (Protocol No.6/2021 dated 15.06.2021) of the Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Health of the Russian Federation.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

FUNDING

No funding was received for this study.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

CONFLICT OF INTEREST

The authors confirm that there is no conflict of interest to declare.

About the authors

Nikolay S. Ivanov

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: greatinsmd@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9927-8445

a pediatric oncologist at the Department of Clinical Oncology 

Russian Federation, Moscow

M. Ya. Yadgarov

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation; Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitology, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation

Email: greatinsmd@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3792-1682
Russian Federation, Moscow; Moscow

D. Yu. Kachanov

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: greatinsmd@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3704-8783
Russian Federation, Moscow

S. S. Larin

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: greatinsmd@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2128-0078
Russian Federation, Moscow

M. D. Mollaev

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: greatinsmd@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0539-6393
Russian Federation, Moscow

E. A. Litvin

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: greatinsmd@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6331-5339
Russian Federation, Moscow

M. A. Maschan

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: greatinsmd@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1735-0093
Russian Federation, Moscow

N. S. Grachev

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation; The I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation (the Sechenov University)

Email: greatinsmd@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4451-3233
Russian Federation, Moscow; Moscow

T. V. Shamanskaya

The Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: greatinsmd@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3767-4477
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files