Introduction. Establishing the cause of hereditary hemolytic anemia (HHA) is necessary not only for an accurate diagnosis but also for choosing a treatment strategy. Deficiencies of red blood cell glycolytic enzymes, primarily pyruvate kinase (PK), but also less common deficiencies of glucose phosphate isomerase (GPI) and hexokinase (HK), are among the causes of HHA. According to international standards, confirmation of a deficiency of a glycolytic enzyme is the presence of mutations in the gene encoding the enzyme and direct measurement of its decreased activity in red blood cells. However, genetic testing is currently not always available in Russia, and results are typically delayed. Regarding the determination of the activity of these enzymes, testing for their activity has not yet been introduced into clinical practice in Russia.
Aim: this study focuses on the development of methods for analyzing the activity of glycolytic enzymes (PK, GPI, and HK). Their implementation in clinical practice will help improve the accuracy of differential diagnosis of HHA caused by enzymopathies.
Materials and methods. Blood from healthy donors and patients with HHA of various etiologies was analyzed. Activity results were expressed as international units per gram of hemoglobin (IU/g Hb). PK, GPI, and HK activities were measured in erythrocyte hemolysates by spectrophotometric methods using coupled biochemical reactions resulting in a change in the optical density of the reaction sample at a wavelength of 340 nm.
Results. Methods for analyzing the enzymatic activity of PK, GPI, and HK in erythrocytes were developed, taking into account all conditions affecting the accuracy of the analysis. The activities of these enzymes were measured in red blood cells of the patients with different hemolytic anemias and donors: PK – n = 452 and n = 95, HK – n = 113 and n = 53, and GPI – n = 7 and n = 30, respectively. The reference intervals of normal values of these activities in erythrocytes were calculated (medians and regions including 2.5% to 97.5% of all the measured values): PK – 10.85 (8.41; 16.42) IU/g Hb (n = 95), HK – 0.90 (0.68; 1.11) IU/g Hb (n = 53), GPI – 44.22 (34.31; 62.35) IU/g Hb (n = 30). It was shown that the activity of these enzymes in the erythrocytes of the patients with a genetically proven defect in the structure of these enzymes and no recent donor red blood cell transfusions was reduced.
Conclusion. The developed biochemical methods for measuring the activity of glycolytic enzymes (PK, GPI, and HK) are highly sensitive and specific. Their use significantly facilitates the differential diagnosis of HHA caused by glycolytic enzyme deficiencies, bringing this diagnostic approach into line with international standards.
Введение. Установление причины наследственной гемолитической анемии (НГА) необходимо не только для определения точного диагноза, но и для выбора стратегии терапии. Одной из причин НГА являются дефициты эритроцитарных ферментов гликолиза, в первую очередь пируваткиназы (ПК), а также реже встречающихся глюкозофосфатизомеразы (ГФИ) и гексокиназы (ГК). По мировым стандартам подтверждением существования дефицита какого-либо фермента гликолиза является наличие мутаций в гене, кодирующем данный фермент, и непосредственное определение снижения его активности в эритроцитах. Однако в настоящее время генетический анализ в России не всегда доступен, и его результаты приходится ждать достаточно долго. Что касается определения активности данных ферментов, то такой анализ в России в клиническую практику пока не внедрен.
Цель работы – разработка методов анализа активности ферментов гликолиза ПК, ГФИ и ГК, внедрение которых в клиническую практику поможет повысить точность дифференциальной диагностики НГА, вызванных ферментопатиями.
Материалы и методы. В работе была исследована кровь здоровых доноров, а также пациентов с НГА различной этиологии. Результаты измерения активности были выражены в Международных единицах на грамм гемоглобина (МЕ/г Hb). Активности ПК, ГФИ и ГК были измерены в гемолизатах эритроцитов спектрофотометрическими методами с помощью сопряженных биохимических реакций, приводящих к изменению оптической плотности реакционной пробы на длине волны 340 нм.
Результаты и обсуждение. Разработаны методы анализа ферментативной активности ПК, ГФИ и ГК в эритроцитах с учетом всех условий, влияющих на правильность проводимого анализа. Измерены активности этих ферментов в эритроцитах пациентов с различными гемолитическими анемиями и доноров: ПК – n = 452 и n = 95, ГК – n = 113 и n = 53 и ГФИ – n = 7 и n = 30 соответственно. Рассчитаны референсные интервалы нормальных значений этих активностей в эритроцитах (медианы и области, включающие от 2,5 до 97,5% всех измеренных значений): ПК – 10,85 (8,41; 16,42) МЕ/г Hb (n = 95); ГК – 0,90 (0,68; 1,11) ME/г Hb (n = 53); ГФИ – 44,22 (34,31; 62,35) ME/г Hb (n = 30). Показано, что значения активности этих ферментов в эритроцитах пациентов с генетически доказанным нарушением в структуре каждого из этих ферментов и отсутствием недавних трансфузий донорских эритроцитов снижены.
Заключение. Разработанные биохимические методы измерения активности гликолитических ферментов (ПК, ГФИ и ГК) высокочувствительны и специфичны. Их использование значительно облегчает дифференциальную диагностику НГА, вызванных дефицитами ферментов гликолиза, и делает ее соответствующей мировым стандартам.