Pediatric Hematology/Oncology and ImmunopathologyPediatric Hematology/Oncology and ImmunopathologyВопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии1726-17082414-9314Fund Doctors, Innovations, Science for Children82010.24287/1726-1708-2024-23-4-78-83ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИIdentification of optimal conditions for the expansion of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells using tools for live-cell culture monitoringОпределение оптимальных условий экспансии мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека с помощью оборудования для прижизненного мониторинга состояния культур клетокhttps://orcid.org/0000-0001-9444-4689DudorovaA. A.ДудороваА. А.
Russian Federation

Moscow

Дудорова Анастасия Андреевна

Москва

dudorova_aa@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3001-4820EfimenkoM. V.ЕфименкоМ. В.
Russian Federation

Moscow

Ефименко Мария Викторовна

Москва

masik_007@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5618-7159KhismatullinaR. D.ХисматуллинаР. Д.
Russian Federation

Moscow

Хисматуллина Рима Данияловна

Москва

Rimma.Chismatullina@fccho-moscow.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1735-0093MaschanM. A.МасчанМ. А.
Russian Federation

Moscow

Масчан Михаил Александрович

Москва

mmaschan@yandex.ruhttps://orcid.org/0009-0000-0448-504XKazminaI. N.КазьминаИ. Н.
Russian Federation

Moscow

Казьмина Ирина Николаевна

Москва

rinakazmina@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7652-7704IlyushinaM. A.ИлюшинаМ. А.
Russian Federation

Moscow

Илюшина Мария Александровна

Москва

Mariya.Ilyushina@fccho-moscow.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1873-3486OsipovaE. Yu.ОсиповаЕ. Ю.
Russian Federation

Elena Yu. Osipova, Head of the Laboratory of Physiology and Pathology of Stem Cells

1 Samory Mashela St., Moscow 117997

Осипова Елена Юрьевна, заведующая лабораторией физиологии и патологии стволовых клеток

117997, Москва, ул. Саморы Машела, 1

e_ossipova@mail.ruThe Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian FederationФГБУ "НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева" Минздрава России1312202423478831202202408042024Copyright ©; 2024, «D. Rogachev NMRCPHOI»Copyright ©; 2024, ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России2024«D. Rogachev NMRCPHOI»ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава Россииhttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://hemoncim.com/jour/article/view/820

Based on the results of our study, we have developed recommendations regarding cell culture media composition for the expansion of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) for preclinical studies and potential clinical applications. ALPHA-MEM supplemented with 10% platelet lysate proved to be the most effective culture medium. Different DMEM media supplemented with fetal bovine serum turned out to be less effective: a maximum of 80% confluence was reached after 80 hours of culture, while MSC confluence in StemMACS and ALPHA-MEM media supplemented with platelet lysate kept increasing even after 100 hours of expansion. The growth rate of MSCs in RPMI-1640 medium was significantly lower than in the other culture media. When culturing MSCs in media with high glucose concentration (4.5 g/L), the percentage of cells with fat transformation after 5 days of culture was higher than in low-glucose (1.0 g/L) media such as DMEM low gl, StemMacs, ALPHAMEM. It is preferable to use MSC expansion media that do not induce spontaneous adipogenic differentiation for culturing MSCs for clinical purposes because the cells remain uncommitted and all their differentiation potential can be used in accordance with the objectives of further research and/or clinical needs. This study was supported by the local Ethics Committee and approved by the Scientific Council of the Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation. All the participants signed the standard informed consent form and agreed to the use of some of their biological materials for research purposes.

По результатам проведенного исследования выработаны рекомендации по составу среды для экспансии мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека для доклинических исследований и возможного клинического применения – наиболее эффективной является среда ALPHA-MEM с добавлением 10% лизата тромбоцитов. Варианты сред на основе DMEM c добавлением эмбриональной телячьей сыворотки оказались менее эффективны – доля конфлюэнтности достигала максимального значения 0,8 через 80 ч культивирования, тогда как конфлюэнтность культур МСК в средах StemMACS и ALPHA-MEM с добавлением лизата тромбоцитов продолжала возрастать и через 100 ч после начала экспансии. Среда на основе RPMI-1640 достоверно хуже других использованных сред поддерживала рост МСК. При культивировании МСК в средах с содержанием глюкозы 4,5 г/л доля клеток с жировой трансформацией через 5 сут выше, чем при культивировании в условиях содержания глюкозы 1,0 г/л – DMEM low gl, StemMacs, ALPHAMEM. Использование для экспансии МСК сред, не индуцирующих спонтанную адипогенную дифференцировку, предпочтительнее для потенциального применения МСК в клинических целях, поскольку клетки остаются некоммитированными и их дифференцировочный потенциал может быть реализован в зависимости от задач дальнейшего исследования и/или клинических потребностей при их применении. Настоящее исследование поддержано локальным этическим комитетом и утверждено решением ученого совета ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. Все участники исследования подписали добровольное информированное согласие по утвержденной форме с возможностью использования части материала для исследовательских целей.

mesenchymal stem cellscell expansionculture mediaadipogenic differentiationplatelet lysateconfluenceмезенхимальные стволовые клеткиэкспансия клетоксреда культивированияадипогенная дифференцировкализат тромбоцитовконфлюэнтность.Frieedenstein A.J., Petrakova K.V., Kurolesova A.I., Frolova G.P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation 1968; 6 (2): 230–47.Kulus M., Sibiak R., Stefanska K., Zdun M., Wieczorkiewicz M., Piotrowska-Kempisty H., et al. Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human and Animal Perinatal Tissues – Origins, Characteristics, Signaling Pathways, and Clinical Trials. Cells 2021; 10 (12): 3278.Lazarus H.M., Haynesworth S.E., Gerson S.L., Rosenthal N.S., Caplan A.I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant 1995; 16 (4): 557–64.Golpanian S., Wolf A., Hatzistergos K., Hare J.M. Rebuilding the damaged heart: mesenchymal stem cells, cell-based therapy, and engineered heart tissue. Physiol Rev 2016; 96 (3): 1127–68.Hoang D.M., Pham P.T., Bach T.Q., Ngo A.T., Nguyen Q.T., Phan T.T., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther 2022; 7 (1): 1–41.Zhou L., Zhu H., Bai X., Huang J., Chen Y., Wen J., et al. Potential mechanisms and therapeutic targets of mesenchymal stem cell transplantation for ischemic stroke. Stem Cell Res Ther 2022; 13 (1): 195–210.Han H.T., Jin W.L., Li X. Mesenchymal stem cells-based therapy in liver diseases. Mol Biomed 2022; 3 (1): 23–74.Gavin C., Boberg E., Von Bahr L., Bottai M., Andrén A.T., Wernerson A., et al. Tissue immune profiles supporting response to mesenchymal stromal cell therapy in acute graft-versus-host disease – a gut feeling. Stem Cell Res Ther 2019; 10: 334– 40.Dabrowska S., Andrzejewska A., Janowski M., Lukomska B. Immunomodulatory and regenerative effects of mesenchymal stem cells and extracellular vesicles: therapeutic outlook for inflammatory and degenerative diseases. Front Immunol 2021; 11: 1–26.Ciervo Y., Ning K., Jun X., Shaw P.J., Mead R.J. Advances, challenges and future directions for stem cell therapy in amyotrophic lateral sclerosis. Mol Neurodegener 2017; 12 (1): 85–107.Leyendecker J.A., Gomes Pinheiro C.C., Amano M.T., Franco Bueno D. The use of human mesenchymal stem cells as therapeutic agents for the in vivo treatment of immune-related diseases: a systematic review. Front Immunol 2018; 9: 1–51.Re F., Borsani E., Rezzani R., Sartore L., Russo D. Bone regeneration using mesenchymal stromal cells and biocompatible scaffolds: A concise rewiew of the current clinical trials. Gels 2023; 9 (5): 389–404.Nikolaeva Yu.A., Skorobogatova E.V., Kirgizov K.I., Pristanskova E.A., Blagonravova O.L., Osipova E.U., et al. Intraosseous infusion of mesenchymal stem cells in treatment of graft-versus-host refractory response with graft hypofunction. Pediatrics. Journal named after G.N. Speransky 2019; 98 (4): 8–14. (In Russ.)Николаева Ю.А., Скоробогатова Е.В., Киргизов К.И., Пристанскова Е.А., Благонравова О.Л., Осипова Е.Ю. и др. Внутрикостное введение мезенхимальных стволовых клеток в терапии рефрактерной реакции «трансплантат против хозяина» с гипофункцией трансплантата. Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского 2019; 98 (4): 8–14.Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F.C., Krause D.S., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8 (4): 315–7.Mushahary D., Spittler A., Kasper C., Weber V., Charwat V. Isolation, cultivation and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A 2018; 93 (1): 19–31.Viau S., Lagrange A., Chabrand L., Lorant J., Charrier M., Rouger K., et al. A highly standardized and characterized human platelet lysate for efficient and reproducible expansion of human bone marrow mesenchymal stromal cells. Cytotherapy 2019; 21 (7): 738–54.Shamanskaya T.V., Osipova E.Yu., Roumiantsev S.A. Mesenchymal stem cells ex vivo cultivation technologies for clinical use. Oncohematology 2009; (3): 69–76. (In Russ.) DOI: 10.17650/1818-8346-2009-0-3-69-76Шаманская Т.В., Осипова Е.Ю., Румянцев С.А. Технологии культивирования мезенхимальных стволовых клеток ex vivo для клинического применения. Онкогематология 2009; (3): 69–77. DOI: 10.17650/1818-8346-2009-0-3-69-76Astakhova N.M., Korel A.V., Kirilova I.A. The development of protocols for isolation, culture and differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Genes and Cells 2017; 12 (3): 128. (In Russ.)Астахова Н.М., Корель А.В., Кирилова И.А. Разработка протоколов выделения, культивирования и типирования мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека. Гены и клетки 2017; 12 (3): 128.Wong C.W., Han H.W., Hsu S.H. Changes of cell membrane fluidity for mesenchymal stem cell spheroid on biomaterial surfaces. World J Stem Cells 2022; 14 (8): 616–32.Jakl V., Popp T., Haupt J., Port M., Roesler R., Wiese S. Effect of expansion Media on functional characteristics of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Cells 2023; 12 (16): 2105–36.Toth G., Szollosi J., Vereb G. Quantitating ADCC against adherent cells: impedance based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A 2017; 91 (10): 1021–9.He L., Li M., Wang X., Wu X., Yue G., Wang T., et al. Morphology-based deep learning enables accurate detection of senescence in mesenchymal stem cell cultures. BMC Biol 2024; 22 (1): 1–17.Parvin Nejad S., Lecce M., Mirani B., Machado Siqueira N., Mirzaei Z., Santerre J.P., et al. Serum- and xeno-free culture of human umbilical cord perivascular cells for pediatric heart valve tissue engineering. Stem Cell Res Ther 2023; 14 (1): 96–111.Even K.M., Gaesser A.M., Ciamillo S.A., Linardi R.L., Ortved K.F. Comparing the immunomodulatory properties of equine BM-MSC culture expanded in autologous platelet lysate, pooled platelet lysate, equine serum and fetal bovine serum supplemented culture media. Front Vet Sci 2022; 25 (9): 1–14.Fitzgerald J.C., Shaw G., Murphy J.M., Barry F. Media matters: culture medium-dependent hypervariable phenotype of mesemchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther 2023; 14 (1): 363–78.Altrock E., Sens-Albert C., Hofmann F., Riabov V., Schmitt N., Xu Q., et al. Significant improvements of bone marrow-derived MSC expansion fron MDS patients by defined xeno-free medium. Stem Cell Res Ther 2023; 14 (1): 156–64.