Pediatric Hematology/Oncology and ImmunopathologyPediatric Hematology/Oncology and ImmunopathologyВопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии1726-17082414-9314Fund Doctors, Innovations, Science for Children89010.24287/1726-1708-2024-23-4-54-57ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИAnalysis of platelet inhibition function by measuring phosphorylation of the intracellular cytoskeleton protein VASP in whole blood over timeАнализ функции ингибирования тромбоцитов по фосфорилированию внутриклеточного цитоскелетного белка VASP в цельной крови во времениhttps://orcid.org/0000-0002-0193-0723ArtemenkoE. O.АртеменкоЕ. О.
Russian Federation

Elena O. Artemenko, a researcher at the Laboratory of Cellular Hemostasis and Thrombosis at the Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

1 Samory Mashela St., Moscow 117997

Артеменко Елена Олеговна, научный сотрудник лаборатории клеточного гемостаза и тромбоза  ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

117997, Москва, ул. Саморы Машела, 1

lartemenko@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0625-1743ChabinI. A.ЧабинИ. А.
Russian Federation

Moscow

Москва

https://orcid.org/0000-0002-8128-7757PanteleevM. A.ПантелеевМ. А.
Russian Federation

Moscow

Москва

Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of SciencesФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАНThe Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian FederationФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава РоссииThe M.V. Lomonosov Moscow State UniversityФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»1312202423454571309202407112024Copyright ©; 2024, «D. Rogachev NMRCPHOI»Copyright ©; 2024, ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России2024«D. Rogachev NMRCPHOI»ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава Россииhttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://hemoncim.com/jour/article/view/890

The state of platelets may depend on the time since blood draw, primarily because of the presence of short-lived inhibitors of platelet activation in circulation. In this work, we analyzed the phosphorylation of vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP), which correlates with platelet inhibition, over time using flow cytometry. The study was approved by the Independent Ethics Committee and the Scientific Council of the Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation. We investigated VASP phosphorylation in platelets in whole blood immediately after the blood was collected and 60 minutes later. As a positive control, we used platelet function inhibition by prostaglandin E1. As a result, it was found that the level of VASP phosphorylation in platelets in whole blood did not differ significantly in samples taken immediately after the blood draw and 60 minutes later, however it was markedly increased with platelet inhibition by prostaglandin E1. Our results suggest that the state of platelets does not change significantly within 60 minutes after the blood draw.

Состояние тромбоцитов может зависеть от времени, прошедшего с момента забора крови, в первую очередь из-за наличия в циркуляции короткоживущих ингибиторов их активации. В данной работе проанализировано фосфорилирование белка VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein), которое коррелирует с функцией ингибирования тромбоцитов в зависимости от времени с помощью проточной цитометрии. Данное исследование одобрено независимым этическим комитетом и утверждено решением ученого совета ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. Мы исследовали фосфорилирование VASP тромбоцитов в цельной крови сразу после ее взятия из вены и через 60 мин. В качестве положительного контроля нами использовано ингибирование функции тромбоцитов с помощью простагландина Е1. В результате мы выяснили, что фосфорилирование VASP в тромбоцитах не отличалось достоверно в цельной крови сразу после ее взятия и через 60 мин, в то время как наблюдалось заметное его увеличение при ингибировании тромбоцитов с помощью простагландина Е1. Полученные данные предполагают, что состояние тромбоцитов не изменяется заметным образом в течение 60 мин после взятия крови из вены.

hemostasisplateletsVASPflow cytometryгемостазтромбоцитыVASPпроточная цитометрияРабота поддержана грантом РНФ № 23-44-00082.Sveshnikova A.N., Stepanyan M.G., Panteleev M.A. Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 1: responses. Part 1: answers. Systems Biology and Physiology Reports 2022; 1 (1): 14–23. (In Russ.)Kadyrov T.I., Sveshnikova A.N., Panteleev M.A. Plasma membrane repair, blebbing and microvesiculation: parallels and relationships. Systems Biology and Physiology Reports 2022; 1 (2): 13–20. (In Russ.)Kovalenko T.A. Annexin V: the membrane-binding protein with diverse functions. Systems Biology and Physiology Reports 2022; 1 (2): 21–33. (In Russ.)Obydennyi S.I. An advantage of lactadgerin in the assessment of phosphatidylserine exposure in platelets. Systems Biology and Physiology Reports 2023; 2 (1): 11–3. (In Russ.)Braune S., Küpper J.H., Jung F. Effect of Prostanoids on Human Platelet Function: An Overview. Int J Mol Sci 2020; 21 (23): 9020. DOI: 10.3390/ijms21239020Broos K., Feys H.B., De Meyer S.F., Vanhoorelbeke K., Deckmyn H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev 2011; 25 (4): 155–67. DOI: 10.1016/j.blre.2011.03.002Horstrup K., Jablonka B., HönigLiedl P., Just M., Kochsiek K., Walter U. Phosphorylation of focal adhesion vasodilator-stimulated phosphoprotein at Ser157 in intact human platelets correlates with fibrinogen receptor inhibition. Eur J Biochem 1994; 225: 21–7.Horstrup K., Jablonka B., Hönig-Liedl P., Just M., Kochsiek K., Walter U. Phosphorylation of focal adhesion vasodilator-stimulated phosphoprotein at Ser157 in intact human platelets correlates with fibrinogen receptor inhibition. Eur J Biochem 1994; 225: 21–7.Butt E., Abel K., Krieger M., Palm D., Hoppe V., Hoppe J., et al. cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation sites of the focal adhesion vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) in vitro and in intact human platelets. J Biol Chem 1994; 269 (20): 14509–17.Chitaley K., Chen L., Galler A., Walter U., Daum G., Clowes A.W. Vasodilator-stimulated phosphoprotein is a substrate for protein kinase C. FEBS Lett 2004; 556: 211–5. DOI: 10.1016/S0014-5793(03)01435-2Smolenski A., Bachmann C., Reinhard K., Hönig-Liedl P., Jarchau T., Hoschuetzky H., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. J Biol Chem 1998; 273 (32): 20029–35. DOI: 10.1074/jbc.273.32.20029Schwarz U.R., Geiger J., Walter U., Eigenthaler M. Flow cytometry analysis of intracellular VASP phosphorylation for the assessment of activating and inhibitory signal transduction pathways in human platelets – definition and detection of ticlopidine/clopidogrel effects. Thromb Haemost 1999; 82 (3): 1145–52.Algahtani M., Heptinstall S. Novel strategies for assessing platelet reactivity. Future Cardiol 2017; 13 (1): 33–47. DOI: 10.2217/fca-2016-0054Mallouk N., Varvat J., Berger A., Epinat M., Accassat S., Garcin A., et al. Assessment of a flow cytometry technique for studying signaling pathways in platelets: Monitoring of VASP phosphorylation in clinical samples. Pract Lab Med 2018; 11: 10–8. DOI: 10.1016/j.plabm.2018.02.002Jakubowski J.A., Payne C.D., Li Y.G., Farid N.A., Brandt J.T., Small D.S., et al. A comparison of the antiplatelet effects of prasugrel and high-dose clopidogrel as assessed by VASP-phosphorylation and light transmission aggregometry. Thromb Haemost 2008; 99 (1): 215–22. DOI: 10.1160/TH07-09-0555Glenn J.R., Dovlatova N., White A.E., Dhillon K., Heptinstall S., Fox S.C. 'VASPFix' for measurement of VASP phosphorylation in platelets and for monitoring effects of P2Y12 antagonists. Thromb Haemost 2014; 111 (3): 539–48. DOI: 10.1160/TH13-07-0581Sudo T., Ito H., Kimura Y. Phosphorylation of the vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) by the anti-platelet drug, cilostazol, in platelets. Platelets 2003; 14 (6): 381–90. DOI: 10.1080/09537100310001598819Srihirun S., Schechter A.N., Piknova B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J Vis Exp 2019; (143): 10.3791/58647. DOI: 10.3791/58647