Preclinical development of a protocol for the manufacturing of anti-CD5 CAR-T lymphocytes for the treatment of T-lineage acute lymphoblastic leukemia and lymphoma

Full Text

Т-линейный острый лимфобластный лейкоз (Т-ОЛЛ) составляет 10-15% всех случаев острых лимфобластных лейкозов у детей и характеризуется достаточно высокой частотой развития рефрактерного течения и рецидивов [1]. Результаты терапии при рефрактерном течении, даже при использовании трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, остаются неудовлетворительными [2].

На текущий момент выбор препаратов с селективным действием в отношении Т-клеточных пред­шественников для пациентов с рефрактерными формами или рецидивами Т-ОЛЛ ограничен применением неларабина [3-5]. В то же время в терапии В-линейных лейкозов хорошо зарекомендовала себя CAR-T (chimeric antigen receptor) клеточная терапия, представляющая собой производство генно-модифицированных Т-лимфоцитов с цитотоксической активностью в отношении CD19 или других антигенов, специфичных для В-клеточной линии дифференцировки [6-10].

Одной из перспективных мишеней для таргетной иммунотерапии является поверхностный антиген CD5, широко экспрессируемый опухолевыми клетками при Т-ОЛЛ, однако использование его при разработке клеточной терапии сопряжено с рядом трудностей ввиду наличия экспрессии маркера на здоровых Т-лимфоцитах, тимоцитах, а также ряде В-клеток [11, 12]. В частности, потенциальными проблемами явля­ются как аутоагрессия (так называемый фратрицид) в процессе производства анти-CD5 CAR-T-лимфоцитов, так и элиминация нормальных клеток иммунной системы наравне с бластными у пациентов с Т-ОЛЛ при применении данной терапии [13].

В процессе производства CAR-T-лимфоцитов проблема фратрицида может быть решена несколь­кими путями: включением этапа генетического редактирования с использованием технологии CRISPR/Cas9, подразумевающего нокаут гена, кодирую­щего CD5, включением в конструкцию белкового модуля, опосредующего внутриклеточную деградацию либо блокирующего экспрессию белка CD5, а также культивированием в присутствии ингибиторов тирозинкиназы, снижающих эффекты фратрицида у трансдуцированных Т-лимфоцитов [14-16]. Однако использование данных методик может быть сопряжено со снижением показателей жизнеспособности и общей клеточности финального продукта, что может создавать трудности в достижении необходимых для клинического применения количественных показателей.

В настоящее время в литературе имеются данные об эффекте снижения экспрессии CD5 Т-лимфоцитами в случае трансдукции их анти-CD5 CAR-вектором. Данный биологический феномен позволяет производить анти-CD5 CAR-T-лимфоциты без дополнительных генетических модификаций, позволяя получить биомедицинский клеточный продукт (БМКП) с необходимыми клеточностью и фенотипом [17, 18].

Целью настоящей работы являлось проведение доклинических исследований для последующего формирования клинического протокола производства анти^5 CAR-T-лимфоцитов в условиях НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование одобрено независимым этическим комитетом и утверждено решением ученого совета НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева.

Производство и характеристика вирусного вектора

Ретровирусный вектор MM25b, содержащий ген CAR и пакующий сигнал (у) вируса мышиного лейкоза Молони, был получен в дар от доктора М.А. Мамонкина (Baylor College of Medicine Houston, Техас, США). CAR содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент из моноклонального антитела H65 к CD5 [19], шарнирную область из человеческого иммуноглобулина G4, трансмембранный и внутриклеточный домены из человеческого CD28, сигнальный домен из человеческого CD3z.

Ретровирусный вектор был получен с использо­ванием упаковочной клеточной линии 293Vec-Galv (Biovec pharma). Клеточную культуру культивировали на двухслойной клеточной фабрике (NEST) с исполь­зованием среды StemMacs (Miltenyi Biotec) при стандартных условиях (37⁰С, 5% СО₂). Конфлюэнтность монослоя (80 ± 5%) оценивали с помощью микроскопии. Трансфекцию осуществляли с использова­нием комплексов плазмидной ДНК с линейным PEI (PolyPlus) в соотношении 1:4 в бессывороточной среде Opti-MEM (Gibco). Через 24 ч проводили полную замену среды. Вируссодержащий супернатант собирали через 48 ч после трансфекции, центрифугировали при 500g в течение 10 мин и пропускали через фильтр 0,45pm PES. Аликвоты вирусного вектора хранили при -80⁰С.

Для определения титра вирусный вектор обрабатывали бензоназой (DiaGene, Россия) в концентрации 50 Ед/мл. Вирусную РНК выделяли с помощью набора HiPure Viral RNA kit (Magen, Китай), затем обрабатывали ДНКазой (DNase I, New England Biolabs, Великобритания) и проводили обратную транскрипцию с использованием набора Реверта-L (AmpliSens, Россия). Подсчет вирусных геномных копий выполняли методом цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ПЦР) на системе QX200 ddPCR System (Bio-Rad Technologies, США) с применением специфиче­ских праймеров (F-5’-CTCCGATTGACTGAGTCGC-3'; R-5'-GAACAGCGAGACCACAAGT-3’) и зонда (FAM-5’- ACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGC-3’) к LTR-элементу ретровируса.

Титр рассчитывали по формуле:

,

где Т - титр (геномные копии/мл); R - объем ПЦР (20 мкл); C - концентрация (копий/мкл); D - коэф­фициент разведения вируса; V - объем образца в реакции (8 мкл).

Процесс производства анти-CDS CAR-T-лимфоцитов

В день 0 осуществляли взятие периферической крови здорового донора в пробирки CPT (Becton Dickinson, США) с последующим выделением мононуклеарных клеток согласно протоколу производителя. Фракции CD4+^ CD8+-клеток сортировали на приборе MACSQuant Tyto (MiLtenyi Biotec) с использованием антител CD4-VioBLue human GMP (MiLtenyi Biotec) и CD8-APC human GMP (MiLtenyi Biotec). Из полученной фракции 5 x 10⁶ клеток вносили в 6-луночный биоре­актор G-Rex (WiLson WoLf Manufacturing, 80240M) в среде TexMacs (MiLtenyi Biotec), содержащей цитокины интерлейкин (IL)-7 и IL-15 (MiLtenyi Biotec) в концентрации 12,5 нг/мл, активировали с помощью реагента TransAct (MiLtenyi Biotec).

Через 24 ч к активированным Т-лимфоцитам добавляли ретровирусный анти-CD5-вектор и реагент Vectofusin-1 (MiLtenyi Biotec) в концентрации 10 мкг/мл. Далее клетки культивировали в течение 13 дней с полной оценкой фенотипа и функциональной активности продукта на +9-й и +14-й дни. Доливку среды осуществляли на +3-й день, замену - на +7-й и +10-й дни.

Оценка клеточного состава, фенотипа и экспрессии CAR методом проточной цитометрии

Исследование экспрессии CD5 проводилось в дни 0, +7, +9 и +14 посредством инкубации клеточной суспензии с моноклональными антите­лами 7-AAD-PerCP (Beckman CouLter), CD3-APC (клон UCHT1, Invitrogen), CD5-PC7 (клон BL1a, Beckman Coulter). Оценивалось относительное количество CD5+-клеток в регионе 7AAD-CD3+-клеток.

В целях оценки фенотипа клеточного продукта клетки инкубировали с моноклональными антителами CD4-Pacific BLue (клон 13В8.2, Beckman CouLter), CD8-Pacific Orange (клон MEM-31, Exbio Diagnostics), CD279-FITC (клон EH12.2h7, Exbio Diagnostics), tigit-ECD (клон A15153G, BioLegend), 7-AAD-PerCP (Beckman CouLter), CD197-PC7 (клон REA108, MiLtenyi Biotec), CD3-APC (клон UCHT1, Invitrogen), CD45RA- APC-A700 (клон 2H4, Beckman CouLter), CD57- APC-A750 (клон REA769, MiLtenyi Biotec). Оценивали экспрессию маркеров истощения, а также следующие популяции Т-лимфоцитов: наивные (CD197+CD45RA+), центральные (CD197+CD45RA^-), эффекторные (CD197^-CD45RA^-) и терминально дифференцированные (CD197^-CD45RA+).

Уровень экспрессии CAR оценивался посредством инкубации клеток с реагентом CD5 CAR-detection FITC (Acro Biosystems), антителами CD45-VioBLue (клон 5B1, MiLtenyi Biotec), CD4-VioGreen (клон REA623, MiLtenyi Biotec), CD3-APC (клон UCHT1, Invitrogen), 7AAD-Per-CP (Beckman CouLter), CD8-APC-Vio770 (клон REA734, MiLtenyi Biotec).

Образцы анализировали на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman CouLter), данные обрабатывали с помощью программы CytExpert 2.3.

Определение числа копий вектора

Для определения числа копий вектора (vector copy number, VCN) клеточный продукт обрабатывали бензоназой (DiaGene, Россия). ДНК выделяли набором ExtractDNA BLood & CeLLs (Евроген, Россия). Подсчет VCN выполняли методом цифровой капельной ПЦР на системе QX200 ddPCR System (Bio-Rad Technologies, США) с применением специфичных праймеров и зонда к LTR-элементу ретровируса и к референсному гену RPP30 (F-5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3'; R-5'- GCGGCTGTCTCCACAAGT-3'; HEX-5'- CTGACCTGAAGGCTCT-3'). VCN рассчитывали по формуле:

Функциональная оценка цитотоксичности, продукции цитокинов и дегрануляции

Для функциональной оценки полученных клеточных продуктов использовали CD5-экспрессирующие клеточные линии Jurkat и Jeko-1, в качестве отрицательного контроля - линию K562. В целях оценки цитотоксичности клеточные линии были трансдуцированы реагентом Incucyte NucLight Red Lentivirus Reagent (EF1a, Puro, Essen BioScience) и селектированы в присутствии пуромицина в концентрации 1 мкг/мл.

Для проведения функциональных тестов из продукта производства в дни +9 и +14 отбирали 10 млн клеток, вносили в среду TexMacs (MiLtenyi Biotec) при отсутствии цитокинов IL-7 и IL-15, инкубировали в течение суток в стандартных условиях.

Цитотоксичность оценивали посредством инкубации 3 x 10⁴ клеток продукта производства с трансдуцированными клеточным линиями в соотношении 1:1 при 37°C и 5% CO₂. С помощью прибора для визуализации клеток Incucyte (Sartorius) фиксировали изображения клеток каждый час в течение 48 ч. Далее анализировали количество красных объектов в зависимости от времени инкубации, рассчитывали значения площади под кривой (Area Under the Curve, AUC).

Оценка дегрануляции и продукции цитокинов проводилась с клеточной линией Jurkat в соотношении 1:1. Для оценки секреции цитокинов дополнительно вносили ингибитор трансмембранного транспорта белков (GoLgiPLug, BD) и инкубировали в течение 3 ч. В целях исследования дегрануляции клетки инкубировали с клеточной линией в присутствии антитела CD107a (клон H4A3, ELabscience) в течение 2 ч. Далее инкубировали с антителами к поверхностным маркерам CD5-Pacific BLue (клон BL1a, Beckman CouLter), CD4-Pacific Orange (клон MEM-241, Exbio Diagnostics), 7AAD-Per-CP (Beckman CouLter), CD3-APC (клон UCHT1, Invitrogen), CD8-APC-Vio770 (клон SK1, Becton Dickinson). Для оценки дегрануляции дополнительно использовали антитело CD107a (клон H4A3, Elabscience). Продукция цитокинов оценивалась посредством внутри­клеточного окрашивания с антителами I FN-g-PE (клон REA600, Miltenyi Biotec), TNF-a-PE-Vio-770 (клон Mab11, Invitrogen) с использованием набора Fix&Perm (Abcam). Анализ образцов проводили на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter), оценивали количество фактор некроза опухоли- и интерферон-продуцирующих клеток, а также CD107a-экспрессирующих в регионе CD3+CD8+.

Для всех функциональных исследований параллельно с оценкой продукта производства были исследованы генетически немодифицированные Т-лимфоциты от идентичного донора (Mock-клетки). Эффект Mock-клеток вычитали из эффекта анти- CD5 CAR-T-лимфоцитов. В целях сопоставимости результатов между собой все функциональные исследования проводились с пересчетом на процент CAR-экспрессирующих Т-клеток.

Оценка эффективности элиминации CD5+-кле- точной линии in vivo

Для эксперимента использовали самок мышей линии NCG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgem1Smoc) в возрасте 6-8 недель, содержавшихся в стандартных условиях питомника лабораторных животных «Пущино» (уникальная научная установка «Био-модель» ИБХ РАН; Биоресурсная коллекция лабораторных грызунов SPF-категории для фундаментальных, биомедицинских и фармакологических исследований, при поддержке Министерства науки и высшего образования (075-15-2025-486)). Экспери­ментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями по уходу за лабораторными животными.

Опухолевые клетки Jurkat модифицировали методом лентивирусной трансдукции для стабильной экспрессии ffluc (firefly luciferase, люцифераза светлячка). Далее клетки вводили в хвостовую вену в дозе по 2,5 к 10⁶ на мышь. На 5-й день, по итогам визуализации опухолей, мышей разделяли на 3 экспериментальные группы и вводили в хвостовую вену эффекторные клетки. Первая группа получала терапию контрольными T-клетками (Mock-T; n = 5), вторая и третья группы - анти-CD5 CAR-T-клетками по 2,5 к 10⁶ (n = 7) и 5 к 10⁶ (n = 7) на мышь соответственно.

Для визуализации опухоли субстрат D-люци- ферин (GoldBio) еженедельно вводили интраперитонеально в концентрации 15 мг/мл. До и после введения субстрата мышей помещали в камеру для наркоза изофлураном в концентрации 1,5-2,5% в течение 5 мин. Через 10 мин после введения

D-люциферина проводили детекцию люминесценции в системе IVIS Lumina III (PerkinElmer, США).

Для оценки персистенции CAR-T-лимфоцитов в периферической крови мышей со дня введения клеточного продукта еженедельно осуществляли забор крови из ретроорбитального синуса.

На 26-й день от введения опухолевых клеток по одной мыши из каждой группы были забраны для проведения гистологического исследования тканей селезенки, легкого и печени.

Оценка персистенции анти-CD5 CAR-T-лимфоцитов в образцах крови мышей

Образцы крови мышей инкубировали с реагентом CD5 CAR-detection (Acro Biosystems), антите­лами anti-Mouse CD45-PE (клон REA599, Sony Biotechnology), 7-AAD-PerCP (Beckman Coulter), CD5-PC7 (клон BL1a, Beckman Coulter), CD3-APC (клон UCHT1, Invitrogen), CD8-APC-Vio770 (клон SK1, Becton Dickinson), CD45-VioBlue (клон 5B1, Miltenyi Biotec), CD4-Pacific Orange (клон MEM-241, Exbio Diagnostics). Далее лизировали с помощью раствора ExCellLyse (Exbio). Каждый образец сопровождался пробиркой негативного контроля, в которую реагент CAR-detection не добавлялся. Анализ образцов прово­дили на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter), оценивали абсолютное количество челове­ческих СD3+-клеток и относительное число CD3+CAR+ Т-лимфоцитов.

Гистологическое исследование

Аутопсийный материал от лабораторных мышей помещался в 10% нейтральный забуференный раствор формалина на 24 ч. Далее ткани помещались в гистологические кассеты. Гистологическая заливка осуществлялась с помощью станции HistoStar (Thermo Fisher Scientific, США). Для гистологической проводки материала использовались аппараты Sakura Tissue-Tek VIP 5 и Sakura Tissue-Tek Xpress Х120. Изготовление срезов осуществлялось с использованием микротома Thermo Fisher Scientific Microm HM 355S.

C помощью иммуногистохимического метода исследования на срезах с парафиновых блоков образцов ткани определялось наличие экспрессии CD3 (Cell Marque, клон MRQ-39), CD5 (Cell Marque, клон SP19) с применением набора ultraView Universal DAB Detection Kit, VENTANA. Для проведения исследования использовалась система Ventana Bench-Mark Ultra с последующим докрашиванием гематокси­лином и автоматическим накрыванием покровными стеклами с помощью системы Dako CoverStainer. Готовые препараты оценивались методом световой микроскопии.

Статистическая обработка

Для статистической обработки результатов исследования использовали программу GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, США). Для всех показателей данные представлены в виде медианы и разброса. Уровень статистической значимости описывался как *, **, *** и **** для значений p <0,05, <0,01, <0,001 и <0,0001 соответственно. Для срав­нения двух выборок применяли парный t-критерий Стьюдента.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нами были проведены 5 процессов производства анти-CD5 CAR-T-БМКП с помощью неавтоматизиро­ванной платформы G-Rex.

В целях исследования эффекта снижения экспрессии маркера CD5 в процессе производства CAR-T-лимфоцитов нами проводилась оценка его экспрессии в дни 0, +7, +9 и +14. При оценке продукта сортинга в день 0 наблюдалась тотальная экспрессия CD5 полученными клетками. При оценке данного маркера на +7-е сутки отмечалось снижение экспрессии до медианного значения 4,1% (разброс 0-7%) с ее полным отсутствием к 9-му дню (рисунок 1).

В целях определения оптимальной длительности процесса производства анти-CD5 CAR-T-лимфоцитов полная оценка состава и функциональных свойств каждого продукта проводилась в дни +9 и +14.

Все 5 процессов демонстрировали удовлетво­рительную динамику экспансии общего количества CD3+-клеток со значимым приростом к +14-му дню. В день +9 кратность экспансии составляла *18,4 с меди­аной количества Т-лимфоцитов 92 (70-104) * 10⁶. В день +14 общее количество Т-лимфоцитов возрастало в 47,6 раза с медианой 238 (192-271) * 10⁶

(рисунок 2А). Экспрессия CAR была высокой как в день +9, так и в день +14 с медианой 88% (69-97%) и 92% (75-96%) соответственно, что демонстрировало статистически незначимую разницу (рисунок 2Б). Таким образом, к +14-му дню возможно получение значимо большего количества Т-лимфоцитов без потери доли CAR-экспрессирующих клеток. Медиана VCN полученных клеточных продуктов составляла 2,81 (2,72-5,6).

При оценке фенотипа Т-лимфоцитов в продукте производства отмечалось преобладание популяции CD197^-CD45RA^- (Tem) (рисунок 3). Медиана их доли среди CD4+-клеток составила 89,3% (82,4-92,6%) на +9-й день и 98,2% (94-99,1%) на +14-й день. Среди CD8+-клеток - 79% (70,8-84,7%) и 97,4% (96-99,3%) соответственно. К +14-му дню отмечался статисти­чески значимый их прирост (р < 0,01). Соотношение CD4:CD8 составляло 1,6 (1,4-2,5) на +9-й день и 1 (0,9-2,4) на +14-й день.

При этом экспрессия маркеров истощения значимо не менялась в зависимости от длительности процесса производства (рисунок 4). К +14-му дню экспрессия CD57 демонстрировала достаточно низкие значения: 0,9% (0,3-3,4%) среди CD4+-клеток и 3,6% (2,4-8,3%) среди CD8+-клеток. Маркер CD279 к +14-му дню экспрессировался на 11% (9,9-14%) CD4+ и 3,7% (2,2-4,1%) CD8+ Т-лимфоцитов. Аналогичным образом экспрессия TIGIT составляла 7% (5,2-12,3%) и 12,5% (8,1-16,8%) соответственно.

Инкубация полученных CAR-T-лимфоцитов с CD5-экспрессирующей клеточной линией демонстрировала высокие показатели дегрануляции и экспрессии цитокинов (рисунок 5). Медиана экспрессии CD107a цитотоксическими Т-лимфоцитами при оценке на +9-й день составила 50% (26-68%), на +14-й день - 63% (38-74%) (р < 0,01).

 

Рисунок 1. Дот-плоты, отражающие кинетику процесса снижения экспрессии СD5

Figure 1. Dot-plots reflecting the kinetics of CD5 down-regulation

 

Рисунок 2. А - динамика темпов экспансии анти-CD5 CAR-T-клеточных продуктов в течение 14-дневного цикла культивации; Б - доля CAR-экспрессирующих Т-лимфоцитов в продукте производства

На графике представлены индивидуальные значения с указанием медианы в дни +9 и +14 и статистической значимости разницы между показателями

Figure 2. A - the changes in the expansion of anti-CD5 CAR-T cell products during a 14-day cultivation process; B - the percentage of CAR-positive T-cells in the product

The graph shows individual values with a median on days +9 and +14 and statistical significance between the values

 

Рисунок 3. Фенотип CAR-Т-лимфоцитов в зависимости от длительности процесса производства

А - индивидуальные значения с указанием медианы и статистической значимости; Б - дот-плоты, отражающие экспрес­сию CD197 и CD45RA CD4+- и CD8⁺-клетками на +9-й день

Figure 3. The phenotype of CAR-T lymphocytes depending on the duration of cultivation

А - individual values with a median and statistical significance; Б - Dot-plots representing CD197 and CD45RA expression by CD4+ and CD8* cells on day +9

 

Рисунок 4. Оценка экспрессии маркеров истощения

Figure 4. The assessment of the expression of T cell exhaustion markers

 

Продукция фактора некроза опухоли также статистически значимо увеличивалась с 42% (12,2-68,3%) до 48% (14-73,9%) (p < 0,01). Экспрессия интерферона-g значимо не изменялась.

Оценка цитотоксичности анти-CD5 CAR-T-лимфоцитов проводилась в отношении клеточной линии Jurkat, которая служила моделью CD5+ Т-линейного лейкоза. Дополнительно цитотоксичность оценивали в отношении CD5+ В-клеточной линии Jeko-1. В качестве отрицательного контроля использовали линию K562, не имеющую на своей поверхности маркера CD5. Оценка цитотоксичности в системе визуализации IncuCyte показала успешную элиминацию CD5+-линий в течение 48 ч. CD5-негативная линия не была элиминирована, отмечалось нарастание количества клеток, схожее по темпам с эффектом Mock- клеток (рисунок 6А).

Для всех 5 процессов производства исследование специфичной цитотоксичности в отношении линии Jurkat проводилось в дни +9 и +14 в соотношениях эффекторных клеток к таргетным 1:1 и 0,5:1. Во всех случаях также наблюдалась успешная элими­нация опухолевых клеток (рисунок 6Б, В). Эффект оценивали путем расчета разницы в значениях AUC, полученных при исследовании Mock-T-клеток и CAR-T-лимфоцитов от идентичных доноров. Стати­стически значимых различий в показателях в зави­симости от длительности культивации получено не было.

В целях оценки эффективности элиминации CD5+ Т-клеточного лейкоза in vivo нами был проведен эксперимент на мышиной модели с использо­ванием клеточной линии Jurkat-ffluc. Учитывая более высокие показатели кратности экспансии и экспрессии CAR-рецептора при длительности процесса 14 дней, данный протокол был выбран

для производства анти-CD5 CAR-T-лимфоцитов для оценки эффективности на мышиной модели.

В полученном продукте, аналогично с получен­ными раннее данными, доля CAR-экспрессирующих клеток была достаточно высокой и составляла 91%. Дозу клеточного продукта на мышь рассчитывали с пересчетом на долю CAR-экспрессирующих клеток (таблица).

На 4-й день от введения клеток Jurkat-ffluc опухоль визуализировалась у всех 19 эксперимен­тальных мышей (рисунок 7А). На 5-й день животным вводились эффекторные клетки в соответствии с распределением на группы. Наиболее высокие уровни люминесценции при последующем наблю­дении отмечались в контрольной группе, получившей Mock-T-клетки, что выражалось в более низких пока­зателях выживаемости (рисунок 7Б, В). В группах мышей, получивших CAR-T-клетки в различных дозах, прогрессия опухолевого роста была менее выражена. Однако было отмечено, что доза 5 млн CAR-T-клеток более эффективно сдерживает опухолевый рост, что также подтверждается при анализе кривых выживае­мости: наблюдается статистически значимая разница между группами с дозами 2,5 млн и 5 млн CAR-T- клеток на мышь (p < 0,01). При длительности наблю­дения 61 день в группе мышей, получившей большую дозу CAR-T-клеток, прогрессия опухоли наблюдалась лишь у одной мыши, в то время как в группе, полу­чившей дозу 2,5 млн, за время наблюдения полного сдерживания опухолевого роста ни у одной мыши достигнуто не было.

Помимо визуализации опухоли в каждую точку наблюдения проводился забор периферической крови мышей в целях оценки персистенции челове­ческих Т-лимфоцитов и доли CAR-экспрессирующих клеток. За время наблюдения человеческие Т-лимфоциты детектировались у всех экспериментальных животных. Наиболее активная пролиферация отмечалась в группах мышей, получивших Mock-T-клетки и СAR-T-лимфоциты в дозе 5 млн клеток на мышь, что, вероятно, связано с изначальной инфузией большего количества клеток.

 

 

Рисунок 5. Функциональная оценка продукта производства на +9-й и +14-й дни: оценка дегрануляции (А) и секреции (Б) цитокинов цитотоксическими Т-лимфоцитами после инкубации с CD5-экпрессирующей клеточной линией Jurkat

Figure 5. Functional assay of CAR-T cells on +9 and +14 days of cultivation: degranulation assay (A) and cytokines production (Б) by CD8+ T-cells after coculture with CD5-expressing

Jurkat cell line

 

Таблица. Характеристика экспериментальных групп мышей

Table. Characteristics of the experimental cohorts of mice

Группа Group	Доза CAR*-клеток на мышь, х106 The dosage of CAR* cells per mouse, х106	Общее количество CD3+-клеток на мышь, х106 Total CD3* cell count per mouse, х106
Mock-T		5,5
CAR-T 1:1	2,5	2,7
CAR-T 2:1	5	5,5

 

У мышей, получивших CAR-T, во все точки наблю­дения детектировались CAR+^летки (рисунок 8). Наиболее длительная персистенция (весь период наблюдения) отмечалась у мышей, получивших дозу 5 млн CAR-T на мышь.

По данным иммуногистохимического исследования, проведенного на 26-й день от введения опухолевых клеток, в тканях животных, получивших Mock-T-клетки, отмечалась выраженная инфильтрация человеческими CD3+ и CD5+ Т-лимфоцитами.

В то же время в группах мышей, получивших CAR-T- клетки, данная инфильтрация практически отсутствовала (рисунок 9).

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка новых подходов к терапии Т-линейных лейкозов, в частности в области клеточных технологий, на текущий момент остается актуальной задачей [20-22].

Учитывая успехи CAR-T-клеточной терапии в лечении пациентов с В-линейным острым лимфобластным лейкозом, большой интерес представляет ее использование в контексте Т-линейных лейкозов. Однако экспрессия опухолевыми клетками при Т-ОЛЛ большинства маркеров зрелых Т-лимфоцитов создает трудности в производстве CAR-T-лимфоцитов, в частности ввиду потенциального фратрицида в процессе производства [13].

 

 

Рисунок 6. Оценка цитотоксичности анти-CD5 CAR-T-лимфоцитов на +14-й день культивации: А - в отношении CD5^^- прессирующих линий Jurkat и Jeko-1 и клеточной линии K562 (отрицательный контроль); Б - в отношении клеточной линии Jurkat в различных соотношениях эффекторных клеток к таргетным (1:1 и 0,5:1); В - суммарные данные полученных значений AUC, рассчитанных как разница между AUC лунок Mock-T:Jurkat и CAR-T:Jurkat в соотношении 1:1

Данные представлены в виде индивидуальных значений с указанием медианы, разброса и статистической значимости

Figure 6. А - cytotoxicity assay of anti-CD5 CAR-T lymphocytes after coculture with CD5-expressing Jurkat and Jeko-1 cell lines and K562 cell line (negative control) on day +14 of cultivation; Б - cytotoxicity assay with the Jurkat cell line with different effec- tor:target ratios (1:1 and 0.5:1) on day +14 of cultivation; В - the comprehensive data on the total area under the curve (AUC) values calculated as the difference between the AUC values for Mock-T:Jurkat and CAR-T:Jurkat wells at a 1:1 ratio The data is shown as individual values with a median, range, and statistical significance

 

Рисунок 7. А - визуализация опухоли посредством детекции люминесценции в 3 экспериментальных группах мышей (Mock-T, 2,5 х 10⁶ и 5 х 10⁶ CAR-T на мышь) в зависимости от времени введения опухолевых (Jurkat-ffluc) клеток. Звездочкой обозначены мыши, взятые для проведения гистологического исследования на 26-е сутки Б - динамика изменения люминесценции в среднем по 3 группам; В - сравнительный анализ выживаемости мышей в соответствии с экспериментальной группой с указанием статистических различий

Figure 7. А - tumor burden assessment by luminescence detection in 3 experimental cohorts of mice (Mock T, 2.5 х 10⁶ and 5 х 10⁶ CAR-T per mouse) depending on the time post tumor cell (Jurkat-ffluc) infusion. The stars indicate the mice, taken for histological assessment on day 26; Б - the average changes in luminescence in three groups; В - a comparative survival analysis of the mice in accordance with the experimental group, the statistical significance is indicated

 

Рисунок 8. Персистенция CAR-экспрессирующих клеток в периферической крови мышей

День 0 - дата введения эффекторных клеток. Данные представлены в виде медианы с указанием разброса

Figure 8. Human CAR+ cell persistence in the peripheral blood of the mice

Day 0 - day of effector cell infusion. The data is shown as a median with a range

 

Данные литературы свидетельствуют о том, что экспрессия CAR к Т-клеточным маркерам способна приводить к интернализации соответствующих белков. Так, например, данный феномен описан при таргетировании широко экспрессируемых Т-лимфоцитами CD5 и CD7. Однако данный процесс не всегда может быть достаточным для обеспечения устойчивости к аутоагрессии [23, 24]. В случае с CD5 экспрессия CAR приводит к интернализации и полной деградации данного маркера, что создает условия для экспансии CAR-T-клеток в отсутствие выраженных эффектов фратрицида [24]. В связи с этим данный маркер является выгодной мишенью для таргетирования при разработке клеточной терапии для пациентов с Т-линейными лейкозами.

В настоящей работе была оптимизирована методика производства анти-CD5 CAR-T-лимфоцитов в условиях естественного снижения экспрессии поверхностного маркера CD5 трансдуцированными Т-клетками.

По данным литературы, период фратрицида CAR-T-лимфоцитами в случае снижения экспрессии CD5 не является длительным ввиду его быстрой интернализации [25]. Результаты нашего исследования также подтверждают данное наблюдение: во всех проведенных процессах произ­водства наблюдались удовлетворительные пока­затели кратности экспансии со значительным приростом абсолютного количества Т-клеток к +14-му дню и выраженным снижением экспрессии CD5 к +7-му дню.

 

Рисунок 9. Иммуногистохимическое окрашивание тканей селезенки (А), легкого (Б) и печени (В) мышей на маркеры CD3 (верхний ряд) и CD5 (нижний ряд)

Стрелками обозначены участки инфильтрации CD3+- и CD5+-клетками

Figure 9. Immunohistochemical staining of the spleen (A), lung (Б), and liver (В) of the mice for CD3 (top row) and CD5 (bottom row) markers

The arrows indicate the sites of infiltration by CD3+ and CD5+ cells

 

Эффективность элиминации опухолевых клеток CAR-T-лимфоцитами определяется способностью полученных клеток к пролиферации и персистенции in vivo, что напрямую зависит от их фенотипа. CAR-T-лимфоциты с фенотипом центральных Т-клеток памяти обладают более высоким пролифе­ративным потенциалом и могут обеспечивать более длительную персистенцию [26]. В случае генерации CAR-T-клеток в условиях фратрицида дополни­тельная активация Т-клеток в процессе производства приводит к формированию более истощенного фенотипа финального продукта [17, 25]. В соответствии с этим полученные нами данные демонстрируют преобладание популяции Tem (CD197^-CD45RA^-) во всех полученных продуктах. Однако оценка экспрессии таких маркеров истощения, как CD279 (PD-1), CD57 и TIGIT, демонстрирует значения, сравнимые с тако­выми у CAR-T-лимфоцитов, полученных в отсутствие фратрицида [27].

Помимо эффекта аутоагрессии формирование более эффекторного фенотипа может зави­сеть от ко-стимулирующего домена, используемого в конструкте химерного рецептора. Так, например, М.А. Мамонкин и соавт. исследовали возможность производства анти-CD5 CAR-T-клеток с ко-стимулирующими доменами из суперсемейства TNFR. Использование данных доменов сопровождалось формированием CAR-T-клеточного продукта с более «молодым» фенотипом центральных клеток памяти. Однако эффекты аутоагрессии в связи с усилением ими экспрессии молекул клеточной адгезии ICAM-1 (Inter-Cellular Adhesion Molecule 1) значительно увеличивались, что было связано с более активным формированием иммуноло­гических синапсов. Использование ко-стимулирующего домена CD28 в данном исследовании приводило к формированию более эффекторного фенотипа, но при этом снижало эффекты аутоагрессии, позволяя получить клеточный продукт с удовлетворительными показателями крат­ности экспансии и функциональными свойствами, что также подтверждается результатами нашего исследования [25].

При исследовании функциональной активности полученных CAR-T-лимфоцитов были отмечены высокие значения дегрануляции и синтеза таких цитокинов, как фактор некроза опухоли и интерферон-g. Оценка цитотоксичности также демонстрировала успешную элиминацию CD5-экспрессирующих клеточных линий Jurkat и Jeko-1.

Нами было проведено исследование элиминации CD5⁺ Т-линейного лейкоза на мышиной модели. Введение 2,5 млн опухолевых клеток приводило к визуализации опухолевых клеток посредством детекции люминесценции у всех экспериментальных мышей. Последующая терапия мышей анти-CD5 CAR-T-лимфоцитами демонстрировала их способность элиминировать опухолевые клетки и способ­ствовала лучшей выживаемости лабораторных животных.

При исследовании доз CAR-T-клеток в объеме 2,5 и 5 млн на мышь, большая доза демонстрировала лучшие показатели сдерживания опухолевого роста и общей выживаемости. В данной группе также наблюдалась длительная персистенция человеческих CAR-T-клеток. При проведении иммуногистохимического исследования тканей животных наблюдалась более выраженная инфильтрация CD3+- и CD5+-клет- ками в контрольной группе. Сопоставление этих данных с результатами детекции люминесценции позволяет предположить опухолевую природу данной инфильтрации. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об эффективности проводимой терапии и демонстрируют длительную персистенцию CAR-T-клеток, несмотря на их более эффекторный фенотип.

В целях определения оптимальной длительности процесса производства все полученные клеточные продукты были оценены на +9-й и +14-й дни. Более длительная культивация CAR-T-клеток приводила к значимому увеличению кратности экспансии, доля CAR-экспрессирующих клеток при этом не сокраща­лась, полученные показатели VCN были сопоставимы с данными литературы [18]. Фенотип Т-лимфоцитов отмечался более выраженным преобладанием популяции Tem без увеличения уровней экспрессии маркеров истощения и без потери функциональной активности в отношении клеточной линии Jurkat. Исследование более длительного протокола производства на мышиной модели также показало достаточно длительную персистенцию CAR-T-клеток. Таким образом, при разработке клинического протокола производства может быть использована как 9-, так и 14-дневная длительность культивации без значимого влияния на качество конечного клеточного продукта. Количественные показатели при этом будут опреде­ляться условиями клинического протокола.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анти-CD5 CAR-T-лимфоциты представляют собой перспективный подход в терапии пациентов с Т-ОЛЛ, сопровождающимися экспрессией маркера CD5. В настоящем исследовании нами был разработан и оптимизирован лабораторный протокол производства анти-CD5 CAR-T-лимфоцитов, показана их эффективность как in vitro, так и in vivo на мышиной модели. Полученные данные могут быть использованы для последующей разработки клинического протокола производства БМКП.

 

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено в рамках государственного задания, ре­гистрационный номер НИОКТР 1023022700111-4 «Разработка вы­сокотехнологического лекарственного препарата для лечения острых Т-лимфобластных лейкозов у детей на основе технологии CAR-T и CAR-NK», работа Волкова Д.В. проведена при поддержке­ гранта Российского научного фонда №25-74-30002.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

 

About the authors

Elvira Ya. Musaeva

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Author for correspondence.
Email: elvira.musaeva@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0003-0581-9472
Russian Federation, Moscow, Russia

Ekaterina A. Malakhova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences

Email: mallahovka@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7334-0706
Russian Federation, Moscow, Russia; Puschino, Russia

Victoria A. Vedmedskaia

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: viktoria.zubachenko@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0001-7247-4844
SPIN-code: 7313-8498
Russian Federation, Moscow, Russia

Daria S. Osipova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: d_ossipova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9968-9332
Russian Federation, Moscow, Russia

Dmitry V. Volkov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: no-reply@eco-vector.ru
ORCID iD: 0000-0002-1800-999X
Russian Federation, Moscow, Russia

Alexandr S. Chernov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: no-reply@eco-vector.ru
ORCID iD: 0000-0001-5371-1656
Russian Federation, Moscow, Russia

Anna S. Fedorova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: no-reply@eco-vector.ru
ORCID iD: 0000-0002-4699-1730
Russian Federation, Moscow, Russia

Mariia S. Fadeeva

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: mailgram@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-6553-2505

Мария Сергеевна Фадеева

 

Russian Federation, Moscow, Russia

Oiuna B. Lodoeva

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: lodoeva.oyuna@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2874-0014
Russian Federation, Moscow, Russia

Elena A. Kulakovskaya

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: alenakulakovskaya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9639-2779
Russian Federation, Moscow, Russia

Tatiana A. Sozonova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: tania_heurly@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-0057-2727
Russian Federation, Moscow, Russia

Alexey V. Stepanov

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: no-reply@eco-vector.ru
ORCID iD: 0000-0003-1616-4408
Russian Federation, Moscow, Russia

Dmitry E. Pershin

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: dimprsh@icloud.com
ORCID iD: 0000-0002-6148-7209
Russian Federation, Moscow, Russia

Michael A. Maschan

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: Michael.Maschan@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0003-1735-0093

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow, Russia

References

Supplementary files