Experience in developing and scaling a protocol for NK lymphocyte enriched cellular product manufacturing for clinical application

Full Text

Использование аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) позволяет улучшить прогноз почти у половины пациентов с резистентными и рецидивирующими формами острого лейкоза [1-4]. Тем не менее остается когорта, в которой, несмотря на проведенную терапию, новый рецидив или посттрансплантационные осложнения приводят к смерти пациента [5, 6].

Применение инновационных типов гуморальной и клеточной иммунотерапии [7-12] в комбинации с алло-ТГСК дает дополнительный шанс пациентам с рефрактерным течением острого лейкоза, решая целый ряд задач: снижение токсичности как непосредственно противоопухолевой терапии, так и режима предтрансплантационного кондиционирования; снижение риска посттрансплантационных осложнений; эффективная элиминация резистентных к другим видам терапии бластов. Значительным преимуществом НК-клеточной терапии в данном контексте является отсутствие выраженной аллореактивности в отношении здоровых негемопоэтических тканей, что позволяет получать выраженный противолейкемический эффект без увеличения риска реакции «транс­плантат против хозяина». Кроме того, НК-лимфоциты обладают естественной противоопухолевой активностью, которая реализуется по антиген-независимому пути, и таким образом делает их универсальными эффекторами по отношению к бластным клеткам, нередко проявляющим фенотипическую пластичность [13-16]. В ряде клинических исследований было показано, что более высокие дозы НК-клеток, поступивших с трансплантатом, а также более ранняя посттрансплантационная реконституция НК-лимфоцитов ассоциированы с более низким риском рецидива и улучшением выживаемости после алло-ТГСК [17-20], что подтверждает важность оптимизации как количественных, так и функциональных характеристик НК-клеток для улучшения клинических исходов трансплантации.

Существует 2 основные стратегии получения дополнительных терапевтических доз НК лимфоцитов: 1) последовательная магнитная селекция большого количества CD56+CD3^--клеток из продукта лейкофереза [21, 22]; 2) ex vivo экспансия НК-лимфоцитов с использованием различных активирующих агентов [23].

Несмотря на ряд преимуществ магнитной селекции, таких как скорость получения финаль­ного продукта и минимальный риск контаминации за счет отсутствия этапа культивации, сегодня все чаще предпочтение отдается именно ex vivo экспансии, поскольку результаты множества научных и клинических исследований подтверждают более выраженный противолейкемический и противовирусный эффекты НК-клеток, прошедших дополнительный этап активации и экспансии [24-29].

Стратегия выбора протокола экспансии построена на оценке взаимодействия 3 групп факторов: 1) источник НК-лимфоцитов; 2) тип активирующего агента; 3) использование магнитной сепарации на одном из этапов процесса.

Для экспансии НК-клеток может быть использована периферическая кровь здорового донора гемопоэтических стволовых клеток, позволяющая получить достаточное для старта процесса количество НК-клеток из сравнительно небольшого объема. В некоторых клинических протоколах источником высокопролиферативных НК-клеток служит пупо­винная кровь, однако ее использование ограничено доступностью биоматериала и сложностью использования в контексте алло-ТГСК, включая обязательный этап CD3+-деплеции в связи с риском Т-клеточной аллореактивности по отношению к донору и транс­плантату.

Исходя из состава и абсолютного количества клеток в стартовой фракции могут быть использованы более безопасные, но дающие меньшую экспансию неклеточные активирующие агенты (различные комбинации цитокинов, конъюгированные с антителами синтетические частицы [30-32]) или же многократно увеличивающие выход НК-лимфоцитов фидерные клеточные линии, которые в то же время требуют тщательного контроля качества финального продукта [33].

В рамках модификации клеточного состава возможны различные степени вмешательства: экспансия чистой фракции CD3^-CD56+-лимфоцитов (минимизирует риск примеси аллореактивных T-лимфо­цитов в финальном продукте при более низкой эффек­тивности экспансии НК-клеток); 2) использование нативной фракции мононуклеаров, в которой поддерживающее микроокружение способствует НК-клеточной пролиферации, однако даже в случае частичной совместимости донора может потребоваться этап удаления из продукта остаточных T-клеток.

Несмотря на значительный терапевтический потенциал, на сегодняшний день в России не зарегистрированы клинические исследования применения НК-лимфоцитов после экспансии в качестве профилактики рецидива острого рефрактерного лейкоза после алло-ТГСК.

Целью настоящего исследования стали разра­ботка и валидация протокола получения обогащенного НК-лимфоцитами биомедицинского клеточного продукта (НК БМКП), а также детальный анализ его фенотипических и функциональных свойств.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование одобрено независимым этическим комитетом и утверждено решением ученого совета НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева.

Клеточные продукты

В работе представлены характеристики НК БМКП (n = 7), полученных путем экспансии из материала 7 здоровых взрослых доноров в период с октября 2023 г. по март 2024 г. в НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева.

Общая схема процесса получения клеточного продукта, обогащенного НК-лимфоцитами

В качестве основы был использован протокол, опубликованный N. Lapteva и соавт. (2012) [34]. Источником НК-клеток для экспансии служили моно- нуклеары здоровых доноров, выделенные из периферической крови методом центрифугирования в градиенте плотности. Для получения НК БМКП к мононуклеарам добавляли фидерную линию K562 и культивировали в течение 14 дней в питательной среде, содержащей интерлейкин (IL)-2.

Источник клеток и параметры культивации

Все этапы процесса, включающие выделение мононуклеаров, культивирование, а также финальную валидацию и заготовку клеточного продукта, были проведены в соответствии с правилами надлежащей производственной практики в условиях чистых помещений.

Для выделения стартовой фракции мононуклеаров были использованы пробирки BD Vacutainer CPT (Becton Dickinson, США) согласно инструкции производителя.

Затем с помощью проточной цитометрии оценивали концентрацию субпопуляций лимфоцитов в полученном образце мононуклеаров (см. раздел «Оценка состава клеточных продуктов») и, исходя из полученных значений, рассчитывали объем стартовой фракции, содержащий 4,0E+06 НК-клеток. К этому объему добавляли 40,0E+06 клеток заранее заготов­ленной фидерной культуры (см. раздел «Клеточные линии»).

Культивацию проводили в одноразовом биореакторе G-Rex100M (Wilson Wolf Manufacturing, США), рассчитанном на максимальный объем 1000 мл. В качестве питательной среды использовали NK MACS GMP Medium (Miltenyi Biotec, Германия) с добавле­нием 10% человеческого тромболизата (см. раздел «Изготовление лизата человеческих тромбоцитов») и рекомбинантного человеческого IL-2 (Miltenyi Biotec, Германия) в концентрации 10 Ед/мл.

Стартовый объем среды для культивации составлял 500 мл, на 5-й день добавляли еще 500 мл, а на 9-й и 12-й дни производили замену половины культивационного объема. Детальная схема процесса приведена на рисунке 1.

 

Рисунок 1. Схема процесса экспансии НК БМКП

На рисунке отражены основные этапы производства и контроля качества клеточного продукта

Figure 1. Scheme of the NK cell product expansion process

The main steps of the NK cell product manufacturing and quality control are shown

 

Клеточные линии

Суспензионные клеточные линии миелоидной лейкемии THP-1 (TIB-202, ATCC, США) и В-лим- фоидных бластов Jeko-1 (CRL-3006, ATCC, США) получены от производителя в виде заморо­женных аликвот, хранящихся в жидком азоте, и после разморозки культивировались в среде RPMI- 1640 (Capricorn Scientific, Германия) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Cytiva, HyClone, США; регион происхождения Северная Америка). Обе линии были модифицированы в целях стабильной экспрессии красного флуоресцентного белка mKate путем лентивирусной трансдукции коммерческим реагентом NucLight Red (EF1a, Puro, Essen BioScience, Германия) с последующей селекцией на пуромицине (ThermoFisher Scientific, США).

Фидерная линия была предоставлена коллегами из лаборатории молекулярной иммунологии под руководством С.С. Ларина (НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева). В качестве фидера была использована клеточная линия K562, стабильно экспрессирующая зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP) и мембранные формы IL-21, CD137-лиганда (41BB) и комплекса IL-15/IL-15Ra. Перед биобанкированием было проведено g-облучение клеток фидера суммарной дозой 100 Гр на приборе Gammacell 3000 Elan (Best Theratronics, США).

Изготовление лизата человеческих тромбоцитов

Концентраты тромбоцитов (КТ) были получены от здоровых доноров-добровольцев, прошедших обследование и подписавших информированное согласие на проведение процедуры автоматического афереза с лейкоредукцией (Terumo BCT, США, версия 7.0). После стандартной обработки было проведено пулирование полученных КТ (объединение равных объемов КТ от 10 разных доноров в целях нивелирования индивидуальных особенностей). На финальном этапе проводили несколько циклов замораживания/размораживания полученного пула с последующим центрифугированием для получения очищенного от дебриса лизата, к которому затем добавляли гепарин в концентрации 15 Ед/мл (ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия). После проведения микро­биологического контроля полученный продукт в течение года хранился при температуре -80°C до востребования.

Контроль качества клеточного продукта

Контроль качества включал в себя оценку субпопуляционного состава (дни 0, 9, 12 и 14), а также тесты на микробиологическую безопасность (дни 0 и 14) и контроль присутствия остаточного фидера (день 14).

Продукт признавался микробиологически безопасным при отсутствии микоплазмы (выявление методом полимеразной цепной реакции с помощью набора Евроген, Myco Real-Time, Россия), эндотоксина (Endosafe, LAL test, США) и отрицательном результате теста на рост микроорганизмов (BD BACTEC, США).

Заключение об отсутствии в финальном продукте остаточного фидера делалось по результатам детекции методом проточной цитометрии. Исходя из данных литературы и параметров чувствительности используемых приборов, нами было установлено пороговое значение не более 0,5% GFP-положительных событий от 1,0E+06 событий из региона живых (7AAD-) клеток.

Оценка состава клеточного продукта

Определение концентрации клеток в продукте проводили волюметрическим методом на проточном цитометре MACSQuant (Miltenyi Biotec, Германия). Развернутый субпопуляционный состав клеточного продукта оценивали на проточном цитометре CytoFlex (Beckman Coulter, США) с использованием многоцветных панелей коммерческих моноклональных антител (таблица 1). Анализ цитометрических данных проводили в программе CytExpert, версия 2.3.0.84 (Beckman Coulter, США).

Оценка функциональной активности клеточного продукта, обогащенного НК-лимфоцитами

Полученный на 14-й день клеточный продукт соединяли с экспрессирующими красный флуорес­центный белок клеточными линиями THP-1 и Jeko-1 в соотношении НК:THP-1/Jeko-1 как 1:1 и 5:1, и проводили съемку на приборе IncuCyte S3 (Sartorius AG, Германия). Изображения регистрировали каждый час в течение 3 сут, а затем проводили их анализ с помощью программного обеспечения IncuCyte Software (v2019B) (Sartorius AG, Германия). Репре­зентативные примеры исходного изображения и результаты его анализа представлены на рисунке 2. Количество красных объектов с течением времени отражает пролиферативную активность опухолевой линии, соответственно, НК БМКП считали функционально состоятельным, если он был способен подавлять пролиферацию бластов относительно контроля. Интегральным показателем пролиферации считали площадь под кривой (area under the curve, AUC) в коор­динатах времени и количества красных объектов на лунку. Данные нормализованы к начальному значению красных объектов на лунку, принятому за 100%.

Статистический анализ и обработка данных

Обработка и статистический анализ данных проводились в программе GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, США). Для статистического анализа были использованы критерии Манна-Уитни, Уилкоксона и коэффициент корреляции Спирмена. Уровень статистической значимости описывался как * и ** для значений p < 0,05 и p < 0,01 соответственно.

 

Таблица 1. Характеристики коммерческих моноклональных антител, использованных для анализа методом проточной

цитометрии

Table 1. The characteristics of commercial monoclonal antibodies used for flow cytometry

Маркер Мarker	Клон Clone	Компания-производитель Manufacturing company	Клеточная популяция Cell population
CD45	J33	Beckman Coulter, USA	Лейкоциты Leukocytes
7AAD	-	Miltenyi Biotec, Germany	Жизнеспособность Viability
CD14	RM052	Miltenyi Biotec, Germany	Моноциты Monocytes
CD16	3G8	Beckman Coulter, USA	HK-лимфоциты/нейтрофилы NK lymphocytes/neutrophils
CD56	NCAM16.2	Becton Dickinson, USA	HK-лимфоциты NK lymphocytes
CD19	J3-119	Miltenyi Biotec, Germany	B-лимфоциты B lymphocytes
CD3	REA613	Miltenyi Biotec, Germany	Т-лимфоциты T lymphocytes
CD4	M-T466	Miltenyi Biotec, Germany	Т-холперы T helpers
CD8	SK1	Becton Dickinson, USA	Цитотоксические Т-лимфоциты Cytotoxic T lymphocytes
TCRab	BW242/412	Miltenyi Biotec, Germany	TCRab Т-лимфоциты TCRab T lymphocytes
TCRyS	REA591	Miltenyi Biotec, Germany	TCRyS T-лимфоциты TCRy8 T lymphocytes
CD197	REA108	Miltenyi Biotec, Germany	Наивный фенотип/фенотип памяти Т-лимфоцитов Naive/memory T cell phenotype
CD45RA	T6D11	Becton Dickinson, USA	Наивный фенотип/фенотип памяти Т-лимфоцитов Naive/memory T cell phenotype
NKG2A	REA110	Miltenyi Biotec, Germany	Субпопуляции HK-лимфоцитов NK lymphocyte subpopulations
NKG2C	REA205	Miltenyi Biotec, Germany
HLA-DR	AC122	Miltenyi Biotec, Germany
CD69	REA824	Miltenyi Biotec, Germany
CD57	REA769	Miltenyi Biotec, Germany

 

Рисунок 2. Репрезентативные примеры исходных изображений, полученных в различные временные точки с помощью системы IncuCyte S3, и результаты их анализа. Красный цвет соответствует контролю, а оттенки синего - разным концентрациям НК-клеток

График иллюстрирует временную динамику количества красных объектов, отражающую пролиферацию опухолевых клеток в присутствии (оттенки синего) и отсутствии (красный) НК БМКП

Figure 2. Representative examples of the initial images acquired at various time points using IncuCyte S3 system along with the corresponding analysis results are presented. Red color corresponds to the control, and shades of blue - to different concentrations of NK cells

The graph illustrates the temporal changes in the number of red objects, reflecting the tumor cell proliferation in the presence (blue) and absence (red) of the NK cell product

 

Если не указано обратное, все приведенные значения представлены в формате медианы с указанием максимума и минимума разброса.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все полученные клеточные продукты успешно прошли контроль качества по заявленным критериям. Медиана содержания остаточной фидерной линии в финальном продукте составила 0,01% (0-0,1%).

В стартовой фракции мононуклеаров медиана содержания НК-клеток ^56^3“) от всех лимфо­цитов составила 14,5% (6,5-24,1%), медиана содержания T-лимфоцитов (CD56^-CD3+) - 71,7% (61,3-81,0%). Вариабельность процентного содер­жания НК-клеток во фракции мононуклеаров была значительно выше, чем T-лимфоцитов (коэффициент вариации 12% и 49% соответственно).

В финале всех 7 процессов был получен клеточный продукт, значительно обогащенный НК-лимфоцитами: медиана содержания НК-клеток ^56^3^-) от всех лимфоцитов составила 88,% (61,4-97,1%).

На 9-й день экспансии медиана тотального количества НК-клеток составила 1,6E+09 (от 0,82E+09 до 2,6E+09), что соответствует увеличению от стартового количества в 284 (194-650) раза, а на 14-й день - 0,8E+09 (от 0,39E+09 до 1,63E+09) и в 200 (96,5-406,7) раз соответственно. Динамика экспансии НК-лимфоцитов представлена на рисунке 3 с детализацией в таблице 2.

Интегральный анализ поверхностных маркеров НК-лимфоцитов указывает на смещение функционального фенотипа в сторону большего проли­феративного потенциала и активации: снижение экспрессии CD57 и повышение экспрессии NKG2A, NKG2C, HLA-DR и CD69 (таблица 3).

Остаточные популяции были представлены следовыми количествами В-лимфоцитов (0,15% (0,03-0,2%)), а также NKT-лимфоцитами (CD56+CD3+) (2,3% (0,5-20,8%)) и T-лимфоцитами (CD56^-CD3+) (8,9% (0,5-20,8%)). Следует отметить, что, несмотря на значительное снижение доли T-лимфоцитов в процессе экспансии, их абсолютное количество в финальном продукте по сравнению со стартовой фракцией увеличилось в 3,7 (1,3-6,2) раза. Также в процессе анализа была выявлена сильная положительная корреляция между процентным содержа­нием T-клеток в стартовой фракции и в финальном продукте (R = 0,954; p = 0,0008). Субпопуляционный состав стартовой фракции и финального продукта представлен на рисунке 4 с детализацией в таблице 2.

 

 

Рисунок 3. Изменение тотального количества HK-лимфоцитов в составе клеточного продукта

Данные представлены в виде наложения индивидуальной динамики каждого из 7 процессов и распределения массива данных в 2 временных точках (9-й и 14-й дни экспансии). Горизонтальнойлиниейобозначенымедианы

Figure 3. The changes in the total number of NK lymphocytes in the cellular product

The data are presented as an overlay of the individual curves for each of the 7 processes, along with the distribution of values at 2 time points (days 9 and 14 of expansion). The horizontal line indicates median values

 

Таблица 2. Индивидуальные характеристики каждого процесса: субпопуляционный состав лимфоцитов стартовой и фи­нальной фракции, а также параметры экспансии НК-лимфоцитов

Table 2. Individual characteristics of each process: lymphocyte subpopulations in the starting and final fractions, as well as the expansion parameters of NK lymphocytes

Номер процесса Process number	Стартовая фракция, % от лимфоцитов Starting fraction, % of lymphocytes				Финальная фракция, % от лимфоцитов Final fraction, % of lymphocytes				Тотальное количество НК-лимфоцитов в клеточном продукте Total number of NK lymphocytes in the cell product		Кратность увеличения количества НК-клеток относительно старта NK cell fold expansion compared to the starting fraction
	CD3+	CD19+	CD56+CD3-	CD56+CD3+	CD3+	CD19+	CD56+CD3-	CD56+CD3+	9-й день Day 9	14-й день Day 14	9-й день Day 9	14-й день Day 14
1	73,6	9,7	7,2	6,1	16,6	0,03	62,3	20,8	1,6E+09	1,3E+09	194,0	163,5
2	59,3	4,8	22,3	11,0	2,4	0,1	95,8	1,1	1,6E+09	1,6E+09	408,4	406,7
3	72,7	12,7	10,1	1,7	20,1	0,2	77,4	2,3	1,1E+09	6,0E+08	283,9	150,0
4	81,0	4,8	6,5	6,7	27,0	0,2	61,4	11,3	1,6E+09	8,0E+08	408,2	200,0
5	69,8	10,3	14,5	3,3	8,9	0,2	88,1	2,9	8,2E+08	3,7E+08	204,0	93,5
6	59,2	12,3	24,1	2,2	4,0	0,15	95,9	0,5	8,2E+08	8,3E+08	205,5	207,5
7	61,8	6,7	20,6	9,8	1,9	0,03	97,1	0,96	2,6E+09	1,3E+09	650,0	332,5
Медиана Median	69,8	9,7	14,5	6,1	8,9	0,15	88,1	2,3	1,6E+09	0,83E+09	283,9	200,0

 

Состав T-клеток, представленных в финальном продукте, был значительно изменен по срав­нению с исходным: среди всех T-клеток процент TCRab значимо уменьшился (с 96,4% до 57,5%; p = 0,0012), также изменилось соотношение CD4+/CD8+ (с 1,9 до 0,3). Фенотип остаточных Т-клеток был представлен более зрелыми высокодифференцированными стадиями по сравнению со стартовой фракцией: среди всех T-клеток процент наивных (CD45RA+CD197+) уменьшился в среднем с 52% до 22%, а эффекторной популяции (CD45RA^- CD197^-) возрос с 20% до 64%. Субпопуляционный состав T-лимфоцитов стартовой фракции и финального продукта представлен в таблице 4.

 

Таблица 3. Экспрессия маркеров HK-лимфоцитов в стартовой и финальной фракциях

Table 3. The expression of NK lymphocyte markers in the starting and final fractions

Маркер Мarker	Старт, % от CD3-CD56+ Start, % of CD3CD56*	Финал, % от CD3-CD56+ Final, % of CD3CD56*
NKG2A	10,6 (0,2-13,2)	23,4 (18,7-28,1)
NKG2C	34,7 (28,2-53,0)	64,7 (48,6-87,2)
HLA-DR	3,7 (3,1-8,9)	52,5 (29,3-75,6)
CD69	1,9 (0,3-25,8)	26,8 (18,0-99,3)
CD57	69,8 (60,7-78,5)	5,7 (4,0-7,4)

 

Рисунок 4. Сравнение субпопуляционного состава лимфоцитов стартовой (внутренняя диаграмма) и финальной (наружная диаграмма) фракций экспансии

Диаграммы построены по значениям медиан (выведены на график), которые были рассчитаны на основе 7 процессов

Figure 4. A comparison of lymphocyte composition in the starting (inner chart) and final (outer chart) fractions

The donut chart depicts median values (displayed on the graph) derived from 7 independent expansion processes.

 

Также все полученные НК БМКП демонстрировали выраженную противоопухолевую активность в in vitro модели с клеточными линиями THP-1 и Jeko-1 (рисунок 5).

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

С учетом преимуществ и ограничений существующих методик ex vivo экспансии НК-лимфоцитов нами был выбран протокол с использованием фидерной линии K562 и фракции мононуклеаров периферической крови, не включающий этап деплеции CD3⁺-лимфоцитов. Данный протокол с незначительными адаптациями на протяжении последних 10 лет широко используется по всему миру в клинических и доклинических исследованиях как самостоятельно, так и в качестве платформы для дальнейших генетических модификаций НК-клеток [24, 29, 35-38].

По результатам проведенного исследования была достигнута 100% выполнимость: 7 из 7 процессов завершились получением НК БМКП, который успешно прошел контроль качества и продемонстрировал высокую функциональную активность in vitro.

В финале всех 7 процессов были получены клеточные продукты, значительно обогащенные НК-лимфоцитами (медиана содержания попу­ляции CD3^-CD56+ составила 88,1%). Медиана тотального количества НК-лимфоцитов составила 0,8E+09 на 14-й день экспансии. Опираясь на данные завершенных клинических исследований, можно утверждать, что полученные нами количественные характеристики клеточного продукта достаточны для обеспечения педиатрическим пациентам медианной дозы 15Е+06/кг (исходя из средней массы пациента 35 кг) [38-41].

 

 

Таблица 4. Развернутый субпопуляционный состав T-лимфоцитов в стартовой и финальной фракциях

Table 4. Detailed T-lymphocyte composition in the starting and final cell product

T-лимфоциты T lymphocytes	Старт, % от CD3+CD56- Start, % of CD3+CD56- |	Финал, % от CD3+CD56- Final, % of CD3+CD56-
CD4+-клетки CD4* cells	61,8 (59,1-67,7)	15,85 (6,7-33,6)
CD4 naive	58,4 (37,4-62,1)	39,8 (14,3-70,1)
CD4 CM	22,0 (6,5-28,4)	11,7 (5,4-17,5)
CD4 EM	22,5 (8,7-35,6)	47,0 (15,0-71,3)
CD4 TEMRA	5,1 (0,8-6)	2,85 (1,0-5,5)
CD8+-клетки CD8* cells	32,2 (25,4-37,2)	48,4 (41,8-74,2)
CD8 naive	48,0 (24,5-65,8)	4,35 (1,4-6,8)
CD8 CM	3,1 (0,3-14,6)	0,9 (0,3-4,9)
CD8 EM	18,7 (6,5-23,5)	84,0 (44,0-92,6)
CD8 TEMRA	27,4 (18,7-59,5)	9,0 (5,8-52,4)
TCRab	96,4 (95,5-98,3)	57,5 (41,3-76,4)
TCRyS	3,6 (1,7-4,5)	50,4 (23,7-61,1)

Примечание. Значения приведены в виде медианы с разбросами по 7 процессам. Naive - наивные клетки (CD197+CD45RA+); CM (central memory) - центральные клетки памяти (CD197⁺CD45RA~); EM (effector memory) -эффекторные клетки памяти (CD197⁺CD45RA~);TEMRA (effector memory CD45RA+) - CD45RA-положительные эффекторные клетки (CD197-CD45RAN. Note. Values are given as a median with ranges calculated based on seven expansion processes. Naive - naive cells (CD197'CD45RA'); CM - central memory cells (CD197+CD45RA-); EM - effector memory cells (CD197+CD45RA~); TEMRA - CD45RA- positive effector cells (CD197~CD45RA^t).

 

Рисунок 5. Результаты анализа функциональной активности НК БМКП

Индивидуальные значения AUC, приведенные на графике, рассчитаны для 5 НК БМКП, соединенных с клеточными линиями THP-1 и Jeko-1 в 2 соотношениях (см. раздел «Материалы и методы»)

Figure 5. The results of the NK cellular product functional assay Individual data points represent the AUC from 5 independent NK cellular products co-cultured with the THP-1 and Jeko-1 cell lines at 2 different effector-to-target ratios (see “Materials and Methods” for details)

 

Также анализ динамики экспансии указывает на возможность дальнейшей оптимизации протокола: во всех процессах максимальное тотальное количество НК-лимфоцитов наблюдалось на 9-е сутки культивирования, после чего их число постепенно снижа­лось (рисунок 3). Сокращение длительности процесса до 10 дней позволит не только увеличить выход таргетной популяции клеток, но и снизить стоимость производства за счет уменьшения расхода питательной среды, а также сократить время ожидания клеточного продукта в рамках клинического прото­кола.

Как уже было упомянуто, протокол экспансии с использованием в роли активатора живых фидерных клеток требует строгого контроля качества финального клеточного продукта. Традиционно для обеспечения безопасности используют воздействие высокими дозами g-излучения, которые блокируют клеточный цикл и останавливают пролиферацию фидерных клеток [42]. Однако в результате значительного стрессового воздействия и длительной культивации с цитотоксическими лимфоцитами фидерные клетки могут терять линейные маркеры, что усложняет их детекцию методом проточной цитометрии. В целях повышения надежности детекции фидерная линия была дополнительно снабжена экспрессией GFP, который позволяет с высокой чувствительностью идентифицировать остаточную популяцию на проточном цитометре за счет интенсивного сигнала в канале FITC [34]. Измеренные описанным методом значения содержания остаточного фидера были значительно ниже установленного порога во всех 7 процессах (медиана 0,1% при пороговом значении 0,5% от всех живых клеток), что свидетельствует в пользу безопасности потенциального клинического применения полученного клеточного продукта.

На 14-й день медиана примеси T-лимфоцитов составила 8,9%, что при средней дозе НК-лимфоцитов 20Е+06/кг составляет соответственно 2Е+06/кг. Согласно клиническим протоколам, такое значение несколько превышает рекомен­дуемые к CD3⁺-деплеции дозы T-клеток. Однако включение в производственный протокол НК БМКП этапа магнитной сепарации должно быть достаточно обосновано, поскольку увеличивает стоимость всего процесса и повышает риск контаминации за счет дополнительных манипуляций. Вместе с тем потенциальное присутствие в финальном клеточном продукте значимой примеси аллореактивных Т-лимфоцитов связано с риском развития реакции «трансплантат против хозяина», поэтому одной из важных задач нашего исследования была подробная характери­стика остаточных T-лимфоцитов.

Расширенный анализ фенотипа остаточных T-клеток выявил преобладание зрелых высокодифференцированных стадий, а также статистически значимое снижение процента популяции TCRab среди всех T-клеток (с 96,4% до 57,5%; p = 0,0012). Полу­ченные данные могут не только свидетельствовать в пользу снижения аллореактивного потенциала примеси Т-клеток, но и указывать на возможный противовирусный эффект, что может явиться преи­муществом для пациентов с высоким риском инфек­ционных осложнений в посттрансплантационном периоде.

Основной целью клинического применения инфузий активированных НК-лимфоцитов является профилактика рецидива, особенно для пациентов с рефрактерными формами ОМЛ [24, 38, 43]. В связи с этим важнейшим этапом валидации полученных НК БМКП было подтверждение их цитотоксической эффективности в отношении не только лимфоидных (Jeko-1), но и миелоидных (THP-1) бластных клеточных линий. Классические методики определения внутриклеточной экспрессии цитокинов и оценки уровня дегрануляции в присутствии опухолевой клеточной линии недостаточно информативны для НК-клеток, полученных путем 2-недельной экспансии, поскольку базовый уровень этих показателей достаточно высок у предварительно активиро­ванных клеток [44]. В связи с этим основным методом функциональной оценки полученного НК БМКП был выбран тест, отражающий способность НК-лимфоцитов напрямую элиминировать опухолевые клетки in vitro. Тест проводился на приборе прижизненной визуализации активности клеток IncuCyte S3, который позволяет также проследить временную динамику противоопухолевой активности цитотоксических лимфоцитов. Все исследованные НК БМКП подавляли пролиферацию бластных клеток, причем в отношении миелоидной клеточной линии THP-1 эффект был более выражен. Полученные результаты не могут быть напрямую экстраполированы на клинический потенциал клеточных продуктов и требуют дополнительного подтверждения в in vivo и in vitro моделях с расширением спектра мишеней и тестируемых соотношений.

Анализ фенотипа НК-лимфоцитов после экспансии выявил существенное повышение экспрессии маркеров активации CD69 и HLA-DR, что указывает на ярко выраженные цитотоксические свойства [45]. Вместе с тем снижение экспрессии маркера терминальной дифференцировки CD57 может свидетельствовать о повышении пролиферативного потенциала и одновременном снижении цитотоксичности по антителозависимому пути [46]. Повышение экспрессии NKG2C связывают с увеличе­нием доли обладающих противовирусной активностью НК-клеток памяти [47]. Одновременно повышение экспрессии ингибирующего рецептора NKG2A может повышать вероятность ухода бластных клеток из-под иммунологического контроля за счет гиперэкспрессии HLA-E [48, 49]. По совокупности представленных фенотипических характеристик сложно сделать однозначный вывод об изменении пролиферативных и цитотоксических свойств НК-лимфоцитов после экспансии, если интерпретировать результаты через призму знаний о нормальной физиологии НК-лимфоцитов в организме, что подчеркивает важность использования in vitro и in vivo моделей для оценки их истинных функциональных свойств.

Несмотря на признанную клиническую эффективность, применение данного вида клеточной терапии имеет целый ряд ограничений. В частности, короткое время персистенции НК-клеток делает их скорее альтернативой высокотоксичной химиотерапии, но не позволяет осуществлять долгосрочный контроль над опухолевым процессом. Также отсутствие этапа CD3⁺-деплеции делает данный вид терапии строго персонализированным, что значительно увеличивает его стоимость и снижает доступность. Несмотря на указанные ограничения, мы рассматриваем настоящий протокол как платформу для разработки НК БМКП следующего поколения с использованием большого спектра генетических модификаций, направленных на придание им антиген-специфичности, способности к длительной персистенции и управляемости.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате настоящего исследования был разработан и валидирован протокол производства НК БМКП. На основании данного протокола планируется проведение пилотного клинического исследования выполнимости и безопасности инфузий донорских НК-клеток для профилактики рецидива лейкоза после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

 

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Не указан.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

 

ORCID

Kulakovskaya E.A. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9639-2779 Belchikov V.E. ORCID: https://orcid.org/0009-0001-7491-6906 Vedmedskaia V.A. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7247-4844 Fadeeva M.S. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6553-2505 Malakhova E.A. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7334-0706 Musaeva E.Ya. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0581-9472 Lodoeva O.B. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2874-0014 Larin S.S. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2128-0078 Lukashina M.I. ORCID: https://orcid.org/0009-0005-0194-4200/ Kibardin A.V. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5021-8065 Mollaev M.D. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0539-6393 Muzalevskii Ya.O. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3513-8299 Kazachenok A.S. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0497-9175 Melkova A.K. ORCID: https://orcid.org/0009-0000-3801-0931 Zavidnyi T.Yu. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4705-401X Trakhtman P.E. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0231-1617 Shelikhova L.N. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0520-5630 Pershin D.E. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6148-7209 Maschan M.A. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1735-0093

About the authors

Elena A. Kulakovskaya

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Author for correspondence.
Email: alenakulakovskaya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9639-2779
Russian Federation, Moscow, Russia

Vladislav E. Belchikov

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: vladbelchikov@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-7491-6906
Russian Federation, Moscow, Russia

Victoria A. Vedmedskaia

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology

Email: viktoria.zubachenko@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0001-7247-4844
SPIN-code: 7313-8498
Russian Federation, Moscow, Russia

Mariia S. Fadeeva

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: mailgram@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-6553-2505
Russian Federation, Moscow, Russia

Ekaterina A. Malakhova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: mallahovka@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7334-0706
Russian Federation, Moscow, Russia

Elvira Ya. Musaeva

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: e.m.69777@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0581-9472
Russian Federation, Moscow, Russia

Oyuna B. Lodoeva

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: lodoeva.oyuna@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2874-0014
Russian Federation, Moscow, Russia

Sergey S. Larin

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: sergei_larin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2128-0078
SPIN-code: 4344-7169

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow, Russia

Marina I. Lukashina

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: mlukashina@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-0194-4200
SPIN-code: 1994-9170
Russian Federation, Moscow, Russia

Alexey V. Kibardin

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: alexey.kibardin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5021-8065
SPIN-code: 3623-0919
Russian Federation, Moscow, Russia

Murad D. Mollaev

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: murad.mollaev@fccho-moscow.ru
ORCID iD: 0000-0003-0539-6393
Russian Federation, Moscow, Russia

Yakov O. Muzalevsky

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: Yakov.Muzalevsky@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0003-3513-8299
Russian Federation, Moscow, Russia

Alexey S. Kazachenok

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: alexeykazachenok@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0497-9175
Russian Federation, Moscow, Russia

Anastasia K. Melkova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: a.melkova@fccho-moscow.ru
ORCID iD: 0009-0000-3801-0931
Russian Federation, Moscow, Russia

Timofei Yu. Zavidnyi

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: no-reply@eco-vector.ru
ORCID iD: 0000-0002-4705-401X
Russian Federation, Moscow, Russia

Pavel E. Trakhtman

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: trakhtman@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0231-1617

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow, Russia

Larisa N. Shelihova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: lshelihova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0520-5630
Russian Federation, Moscow, Russia

Dmitry E. Pershin

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: dimprsh@icloud.com
ORCID iD: 0000-0002-6148-7209
Russian Federation, Moscow, Russia

Michael A. Maschan

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: Michael.Maschan@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0003-1735-0093

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow, Russia

References

Supplementary files