Селективное обогащение популяции редких клеток костного мозга для электронной микроскопии

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) – уникальный метод, в силу своего высокого разрешения позволяющий исследовать ультраструктуру клеток, а также изменения, происходящие в ней в норме и патологии. Одним из препятствий к более широкому использованию ПЭМ в диагностических целях является сложность получения образца, обогащенного исследуемыми клетками, пригодного для применения данного метода. Цель исследования – разработка способа выделения мегакариоцитов из пунктата костного мозга с помощью иммобилизованных на подложке антител к их поверхностным антигенам и протокола пробоподготовки выделенных таким образом клеток для исследования методом ПЭМ. Работа одобрена независимым этическим комитетом и утверждена решением ученого совета ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. Для выделения мегакариоцитов использовался монафрам (F(ab')2 – фрагмент мышиного моноклонального антитела к гликопротеину IIb–IIIa), адсорбированный на предметном стекле, модифицированном диметилдихлорсиланом. Суспензия мононуклеаров, выделенных из пунктата костного мозга в градиенте Histopaque 1077, инкубировалась с иммобилизованными антителами в течение 2 ч при температуре 4°С с перемешиванием 1 раз в 20 мин. Затем образец промывали для удаления неспецифически связанных клеток, фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом, постфиксировали 1% водным раствором тетраоксида осмия, дегидратировали в ацетоне с концентрацией 30, 50, 70, 90 и 100% и пропитывали смолой Epon 812 с ацетоном в соотношениях 1:2 и 2:1 слоем не толще 0,3–0,5 мм. После застывания первого слоя смолы над областью со связанными клетками приклеивали цилиндр из смолы диаметром 8 мм и высотой 10 мм и снова полимеризовали. После застывания полимеризованную смолу отделяли от стекла с помощью скальпеля, нарезали на ультрамикротоме и исследовали на трансмиссионном электронном микроскопе. С помощью описанного протокола были исследованы пунктаты костного мозга 3 пациентов с эссенциальной тромбоцитемией. Было получено согласие доноров и пациентов и/или их законных представителей на забор костного мозга и будущие биомедицинские исследования. Полученные электронные микрофотографии содержат характерные признаки мегакариоцитов: рыхлое ядро, гранулы и пузырьки демаркационной мембранной системы и соответствуют литературным данным. Описанный в работе протокол позволяет получить образцы для ПЭМ, обогащенные редкими клетками крови или костного мозга, существенно экономя временные и финансовые затраты на пробоподготовку и съемку образцов. Предложенный подход является универсальным и может быть использован не только для мегакариоцитов, но и для других клеток, в том числе при исследовании эритроидных предшественников.