Morphology of a pure hematogone population isolated from normal and hematogone-rich bone marrow

Full Text

Гематогоны впервые были описаны как незрелые лимфоидные клетки, присутствующие в мазках костного мозга (КМ) [1]. По мере накопления данных о поверхностных антигенах, специфичных для В-лимфоцитов на различных стадиях созревания, было доказано, что гематогоны являются нормальными предшественниками В-клеток и нормальными аналогами бластов при В-клеточном остром лимфобластном лейкозе (B-ОЛЛ) [2-9]. Созревание предшественников В-клеток можно разделить на несколько стадий, распознаваемых по экспрессии нескольких поверхностных или внутриклеточных маркеров. Наименее зрелыми гематогонами (стадия 1) являются CD34^bright, CD10^bright, CD19^dim, CD22^dim, CD20^-; промежуточные пре-В-клетки (стадия 2) отрицательны по CD34 и имеют слабую экспрессию CD10, CD20, CD22 и CD19^bright. На 3-й стадии созревания гематогоны CD10^dim и CD22^dim не только положительны по CD19, но и приобретают экспрессию CD20 и частично поверхностных иммуноглобулинов [10-12]. Гематогоны составляют не более 5% клеток аспирата здорового КМ [10]. Однако их количество может временно увеличиться более чем на 50% во время восстановления после химиотерапии или трансплантации КМ у пациентов с негематопоэтическими новообразованиями, аутоиммунными заболеваниями или инфекциями [13-15]. Это временное увеличение количества нормальных предшественников В-клеток может быть ошибочно принято за В-ОЛЛ, поскольку гематогоны и опухолевые клетки при В-ОЛЛ имеют схожие морфологию и иммунофенотип [7].

Гематогоны были подробно исследованы методом проточной цитометрии у пациентов с их транзиторным доброкачественным увеличением. Большинство этих исследований посвящено критериям дифференци­ации между гематогонами и бластами, характерными для В-ОЛЛ [11, 15-19]. Основные морфологические характеристики гематогонов также были получены из образцов КМ пациентов с их повышенным количе­ством [11, 13]. В нескольких исследованиях сообщалось о морфологической гетерогенности гематогонов [19-21] по сравнению с несколько более однородной морфологией бластов при В-ОЛЛ. Полученная таким образом информация является неполной, поскольку незрелые клетки в мазках КМ без дополнительного окрашивания не всегда могут быть надежно классифицированы как гематогоны, а не как клетки-предшественники другой линии.

В.Y.P. Hokland и соавт. [7] и T. Fukushima и соавт. [22] использовали более строгий подход к очистке гематогонов и выделили CD10⁺-мононуклеарные клетки из аспиратов КМ пациентов с острыми лейкозами в стадии полной ремиссии, негемопоэтическими опухолями с отсутствием метастазов в КМ, доброкачественными заболеваниями крови (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, наследственный сфероцитоз) и другими заболеваниями (инфекционный мононуклеоз, гистиоцитоз из клеток Лангерганса) для последующего морфологического исследования с использованием проточного клеточного сортера. Помимо предшественников В-клеток CD10 экспрессируются на зрелых гранулоцитах и лишь небольшой части Т-клеток [23], так что в отсутствие В-ОЛЛ всю популяцию CD10⁺-мононуклеарных клеток КМ можно рассматривать как гематогоны. Однако морфология гематогонов в нормальном КМ не изучалась из-за малого их количества.

В данной работе описана морфология CD10+- фракции мононуклеарных клеток, выделенной из аспиратов КМ 12 здоровых доноров и 14 пациентов с новообразованиями, не связанными с созреванием В-клеток или незлокачественными заболеваниями крови, приводящими к реактивному увеличению гематогонов. CD10⁺-клетки получали из мононуклеарной фракции аспирата КМ путем инкубации с клеточным биочипом, прозрачной пластиковой подложкой с иммобилизованными моноклональными антителами к дифференцировочным CD-антигенам [24]. Ранее было показано, что связывание клеток с биочипом является высокоспецифичным, а захваченные биочипом лейкоциты морфологически идентичны лейкоцитам в мазках крови и КМ. В данном исследовании описаны основные морфологические типы CD10+ В-клеточных предшественников и исследована экспрессия CD34, CD19, CD20, CD22 и иммуноглобулина класса М (IgM) на их поверхности, чтобы соотнести иммунологические стадии созревания гематогонов с их морфологией.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

Пациенты

Были исследованы аспираты КМ 12 здоровых доноров в возрасте от 4 до 22 лет (средний возраст 9 лет, 8 пациентов мужского пола, 4 - женского), полученные в ходе подготовки к гаплоидентичной трансплантации КМ, и 14 пациентов в возрасте от 1 до 15 месяцев (средний возраст 8,5 месяцев, 9 мальчиков, 5 девочек) с различными новообразованиями или незлокачественными заболеваниями (8 пациентов с нейробластомой, 2 - с острым миелоидным лейкозом, 2 - с агранулоцитозом, 1 - с аутоиммунным лимфопролиферативным синдромом, 1 - с неизвестным диагнозом, у которого острый лейкоз был исключен) и повышенным уровнем гематогонов по данным проточной цитометрии. Данное исследование одобрено независимым этическим комитетом и утверждено решением ученого совета НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. Было получено согласие доноров и пациентов на забор КМ и будущие биомедицинские исследования.

 

Изготовление клеточных биочипов

Клеточные биочипы были изготовлены путем адсорбции анти-CD-антител на пластиковые покровные стекла, как описано в работе А. N. Khvastunova и соавт. [24]. При изготовлении клеточных биочипов были использованы монокло­нальные мышиные антитела к человеческому CD2 (клон LT2), CD10 (клон LT10), CD19 (клон LT19), CD20 (клон LT20), CD22 (клон LT22) и IgM (ООО «Сорбент», Россия), к человеческому CD45RA (клон HI100; eBioscience, США) и изотипический контроль (P3.6.2.8.1; eBioscience, США) в качестве отрицатель­ного контроля.

 

Сортировка лейкоцитов при помощи клеточного биочипа

Мононуклеарную фракцию аспирата КМ сортиро­вали с помощью клеточного биочипа в соответствии с ранее описанным протоколом [24]. Мононуклеарную фракцию выделяли из аспирата КМ путем центрифугирования в градиенте Histopaque 1077 (Sigma, США) в соответствии с инструкцией производителя, отмывали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,2-7,4, с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA; Sigma, США) и 20% фетальной телячьей сывороткой (FCS; Sigma, США) в концентрации 5 к 10⁶ клеток/мл, заливали на биочип и инкубировали в течение 45 мин при 11°C без пере­мешивания. Далее биочип промывали в PBS с добавлением 1% BSA, затем в PBS, заливали 20 мкл чистой FCS и высушивали в лабораторной цитоцентрифуге. Для морфологического анализа клетки, связавшиеся с биочипами, окрашивали по Май-Грюнвальду-Гимзе и исследовали с помощью микроскопии в светлом поле. Процент мононуклеарных клеток, положительных по каждому CD, включенному в панель биочипа, определяли как плотность связывания мононуклеаров на соответствующем пятне иммоби­лизованных антител к данному CD на биочипе, норма­лизованную на плотность связывания клеток в пятне положительного контроля (анти-CD45RA), как было обосновано ранее [24]. Плотность связывания клеток оценивали полуавтоматически на основе анализа микрофотографий клеток, связавшихся с биочипом, при увеличении в 200 раз.

 

Иммунофлуоресценция

Мононуклеарную фракцию аспирата КМ, выделенную, как описано выше, и ресуспендиро- ванную в PBS с 1% BSA и 20% FCS в концентрации 10⁷ клеток/мл окрашивали моноклональными мыши­ными антителами к CD34-FITC (клон 561; Biolegend,

США) в 1% BSA в PBS при комнатной температуре в течение 30 мин, затем промывали в том же буфере. Меченые клетки инкубировали с биочипом, отмывали и сушили, как описано ранее [24]. Затем клетки, связавшиеся с биочипом, фиксировали в 1% растворе формальдегида в PBS при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем альдегидные группы инактивировали в 100 мМ растворе глицина при комнатной температуре в течение 1 мин, далее биочип со связанными клетками промывали в PBS и визуализировали либо непосредственно с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии (Axio Observer.Z1, Carl Zeiss, Германия), либо с помощью протокола ферментативного усиления флуоресцентного сигнала.

 

Ферментативное усиление флуоресцентного сигнала

Окрашенные анти-CD34-FITC клетки, связанные с биочипами, приготовленные, как описано выше, инкубировали со вторичными козьими антителами против FITC, конъюгированными со щелочной фосфатазой (ЩФ) (ab6657, Abcam, США) в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере, промы­вали TBS (набор для определения PNA ISH, Dako, Дания), а затем инкубировали с субстратом ЩФ BCIP/ NBT (набор для определения PNA ISH, Dako, Glostrup, Дания) в течение 45-60 мин при комнатной температуре во влажной камере. Затем образец промывали водопроводной водой, высушивали и хранили при комнатной температуре до 1 нед перед анализом. Анализ проводился методом световой микроскопии в светлом поле.

 

Микроскопия светлого поля

Морфологию клеток и результаты иммуноцитохимии с ферментативным усилением изучали с помощью микроскопа Nikon Eclipse Ni, оснащенного камерой Nikon DS-Ri1 (Nikon, Нидерланды), при увеличении в 1000 и 200 раз. Измерение размера клеток проводилось с использованием программного обеспечения ImageJ. Морфологическая классификация клеток для каждого донора или пациента проводилась независимо двумя морфологами. Для каждого донора или пациента было проанализировано не менее 100 клеток для каждого пятна анти-CD- антител. В качестве контроля для зрелых В-клеток был измерен размер 50 мононуклеаров периферической крови, связавшихся с анти-CD^.

 

Оценка количества CD34+-клеток

Фотографии мононуклеаров КМ, меченых анти-CD34-FITC, в светлом поле после ферментативного усиления, в пятнах биочипов анти-CD10 (эксперимент) и анти-CD3 (отрицательный контроль) были сделаны в одинаковых условиях, после чего их преобразовали в оттенки серого, инвертировали и вычли фон. Фотографии флуоресценции анти-CD34- FITC анализировали непосредственно после вычитания фона. Интенсивность сигнала анти-CD34 для каждой клетки оценивали как среднюю в пределах границ клеток. Весь анализ изображений прово­дился с использованием программного обеспечения ImageJ. В каждом эксперименте строили гистограмму интенсивности сигнала для отрицательного контроля; пороговая интенсивность для CD34+ была установ­лена выше 95% клеток отрицательного контроля.

 

Статистический анализ

Данные представлены либо в виде среднего значения ± стандартное отклонение, либо в виде диапазона (медианы). При сравнении данных для нормального КМ и КМ, богатого гематогонами, использовался критерий Манна-Уитни.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

Доля мононуклеаров, положительных по различным В-клеточным маркерам, в нормальном костном мозге и костном мозге пациентов с повы­шенным уровнем гематогонов

На рисунке 1 представлена доля клеток, поло­жительных по различным маркерам лимфоцитов, среди мононуклеаров, выделенных из аспирата КМ 14 пациентов с повышенным количеством гематогонов и 12 здоровых доноров. У пациентов с повышенным количеством гематогонов количество Т- и NK-клеток (CD2+) было ниже, а общее коли­чество В-клеток (CD19+), гематогонов (CD10+), зрелых В-клеток (sIgM+) - выше, чем у здоровых доноров.

 

Морфологические характеристики предшественников В-лимфоцитов в нормальном костном мозге

В результате детального анализа CD^-мононуклеаров, выделенных из аспирата нормального КМ, было выделено 3 группы, морфологически отличающиеся между собой (рисунок 2). Самые крупные клетки с высоким и средним ядерно-цитоплазматиче­ским соотношением, синей цитоплазмой с перинуклеарным просветлением, кружевной или мелкосетчатой структурой хроматина и 1-2 ядрышками (рисунок 2А-Г) далее будут иметь название «бласты», поскольку они морфологически наиболее близки к бластам при В-ОЛЛ [21]. Клетки среднего размера с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением и нежным рисунком хроматина, синей цитоплазмой без перинуклеарной зоны и четко видимых ядрышек (рисунок 2Д-З) далее будут называться крупными предшественниками. Клетки этих 2 морфологических типов обычно идентифицируют в мазках КМ как гематогоны. Третья морфологическая группа включает оставшиеся клетки, связавшиеся с антителами к CD10 на биочипе: небольшие клетки с наибольшим соотношением ядра и цитоплазмы, незрелым хрома­тином и отсутствием видимых ядрышек (рисунок 2И-М). Бласты имеют наибольший размер - 13-17 мкм в диаметре, диаметр крупных предшественников - более 10 мкм и до 15 мкм. Третья группа CD10⁺-клеток имеет наименьший размер - 7-10 мкм в диаметре.

Большинство более мелких CD10⁺-клеток похожи по морфологии на крупные предшественники, имеют сходную структуру с хроматином и ядерно-цитоплазматическое соотношение, но меньший размер, хотя у некоторых из них наблюдается более конденсированный или более грубый хроматин. Средний диаметр зрелых В-клеток, выделенных из периферической крови здоровых доноров, измеренный тем же методом, составляет 10 ± 1 мкм.

 

Доля бластов и крупных предшественников среди CD10+-, CD19+-, CD20+-, CD22+- и sIgM+^оно- нуклеаров костного мозга

Процент бластов и крупных предшественников среди мононуклеаров КМ, положительных по основным В-клеточным маркерам, у здоровых доноров и пациентов с повышенным количеством гематогонов представлен на рисунке 3. У здоровых доноров количество бластов варьирует в пределах 1,4-9,3% (медиана 3%), доля крупных предшественников составляет 2,7-24,6% (медиана 11%) СD10⁺-мононуклеаров. В КМ у большинства здоровых доноров бласты и крупные предшественники также присутствовали среди CD19+- и CD20⁺-клеток, но отсутствовали среди CD22+- или sIgM⁺-клеток, только в 1 образце здорового КМ были найдены несколько крупных предшественников в пятне анти- CD22. Отсутствие клеток с бластной морфологией и крупных предшественников среди CD22+- и sIgM+- клеток указывает на их иммунологическую незре­лость и согласуется с ранее опубликованными данными [10, 25].

 

Рисунок 1. Процент мононуклеаров, положительных по CD2, CD10, CD19, CD20, CD22 и sIgM, в нормальном КМ (доноры) и КМ пациентов с повышенным уровнем гематогонов (пациенты), рассчитанный как плотность связывания клеток с различными анти-CD-антителами на биочипе, нормализованная на плотность связывания клеток с анти-CD45 (положительный контроль)

Столбиками представлены средние значения, усы - 95% доверительный интервал

Figure 1. The percentage of mononuclear cells positive for CD2, CD10, CD19, CD20, CD22 and sIgM in the normal BM obtained from the donors and in the BM of the patients with an increased number of hematogones calculated as the density of cell binding to different anti-CD-antibodies on a microarray normalized to the density of cell binding to anti-CD45 (positive control)

The bars indicate the mean values, while the whiskers represent a 95% confidence interval

 

 

Рисунок 2. Морфологические группы гематогонов в КМ: A-Г - бласты; Д-З - крупные предшественники; И-М - другие. Стрелки указывают на клетки соответствующих типов. Окраска по Романовскому-Гимзе, к 1000; Н - распределение по размеру гематогонов различных морфологических групп. Размеры гематогонов были проанализированы у 3 здоровых доноров, не менее 100 клеток для каждого донора

Ящики обозначают межквартильный интервал, усы - минимальное и максимальное значения, горизонтальная линия - медиану, квадрат - среднее значение

Figure 2. Morphological groups of hematogones in BM: A-Г - blast cells; Д-З - large precursor cells; И-М - others. The arrows show cells of the corresponding groups. The Romanowsky-Giemsa staining, к 1000; Н - the distribution of morphologically different hematogones by size. The size of hematogones was analyzed in 3 healthy donors, at least 100 cells for each donor

The boxes show the interquartile interval, the whiskers represent the minimal and maximal values, the horizontal lines show the medians, and the squares indicate the mean values

 

Рисунок 3. Процент клеток с морфологией бластов (A) и крупных предшественников (Б) среди мононуклеаров, связав­шихся с анти-CDW, анти-CD^, анти-CD20, анти-CD22 и анти-IgM на клеточном биочипе, для здоровых доноров (серые ящики) и пациентов с повышенным уровнем гематогонов (белые ящики)

Ящики обозначают межквартильный интервал, усы - минимальное и максимальное значения, горизонтальная линия - медиану, квадрат - среднее значение; значения p рассчитаны на основе критерия Манна-Уитни, звездочкой обозначены значимые различия (p < 0,05)

Figure 3. The percentage of cells with blast cell morphology (A) and large precursor cell morphology (Б) among mononuclear cells bound to anti-CD10, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, and anti-IgM on a cell biochip, for the healthy donors (grey boxes) and for the patients with increased numbers of hematogones (white boxes)

The boxes show the interquartile interval, the whiskers represent the minimal and maximal values, the horizontal lines show the medians, the squares indicate the mean values; p-values are calculated using the Mann-Whitney test, the asterisks indicate significant differences (p < 0.05)

 

 

Рисунок 4. Иммуноцитохимическое окрашивание гематогонов анти-^34: A, Б - фотографии окрашенных анти- CD34-FITC мононуклеаров Км, связавшихся на биочипе с анти-Ж (A) и анти-CDW (Б) после ферментативного усиления с использованием вторичных антител к FITC, конъюгированных с щелочной фосфа- тазой, и субстрата BCIP/NBT (см. раздел «Материалы и методы исследования»), * 1000; В - распределение по размеру CD10+- (черный цвет) и CD10+CD34+- (серый цвет) мононуклеаров, выделенных из нормального КМ (объединенные данные из 3 нормальных образцов КМ, 750 отдельных клеток); Г - определение порогового значения (пунктирная линия) по интенсивности сигнала CD34⁺-клеток (черный цвет) по сравнению с отрицательным контролем (серый цвет)

Figure 4. Immunocytochemical staining of hematogones for CD34 (anti-CD34 stain): А, Б - images of mononuclear cells of BM stained with FITC anti-human CD34 antibody that bound on a microarray to anti-CD3 (A) and anti-CD10 (Б) after enzyme enhancement using FITC secondary antibodies conjugated with alkaline phosphatase and BCIP/NBT substrate (see Materials and Methods), * 1000; В - the distribution of CD10+ (black color) and CD10+CD34+ (grey color) mononuclear cells isolated from normal BM (collective data obtained from 3 normal BM samples, 750 individual cells) by size; Г - the determination of a threshold value (dash line) of the signal intensity of CD34+ cells (black color) in comparison with the negative control (grey color)

 

У пациентов с повышенным количеством гематогонов 0-9,4% (медиана 1,1%) среди CD^-мононуклеаров составляли бласты, а 0-17,2% (медиана 9%) - крупные предшественники. Интересно, что у пациентов с повышенным количеством гематогонов значительно больше бластов имели экспрессию CD22 (рисунок 3). Кроме того, крупные предшественники составляли значительно меньший процент клеток CD19+ у пациентов с повышенным коли­чеством гематогонов, чем в контрольной группе. Это согласуется с тем фактом, что реактивное увеличение количества гематогонов сопровождается увеличением количества зрелых В-клеток (рисунок 1).

 

CD34+-гематогоны морфологически не являются преимущественно бластами или крупными предшественниками

Клетки КМ с бластной морфологией обычно считаются наиболее незрелыми. Чтобы выяснить, имеют ли CD34⁺-гематогоны на первой стадии их созревания преимущественно бластную морфологию, мы построили распределение CD34+CD10+- клеток по размерам в нормальных аспиратах КМ и сравнили его с распределением по размерам всей популяции CD10+. Клетки с бластной морфологией имеют диаметр более 13 мкм (рисунок 2), таким образом, если они преобладают среди клеток CD34+, то это повлияет на распределение последних по размерам.

Мононуклеарные клетки, выделенные из КМ здоровых доноров, были помечены анти-CD34-FITC и затем проинкубированы с биочипом. Относительное количество CD10+CD34+ и CD10+CD34^- было определено у 6 здоровых доноров, у 3 из них методом прямой иммунофлуоресценции, а у остальных 3 - после ферментативного усиления флуоресценции (рисунок 4А, Б). В среднем 20 ± 8% мононуклеарных клеток, связавшихся на биочипе с анти-^10, были положительны по CD34. На рисунке 4В показано распределение по диаметру клеток CD34+CD10+ и всех CD10⁺-клеток. Большинство CD34⁺-клеток имеют диаметр менее 12 мкм, и существенных различий между распределением по размеру CD34+CD10+ и всех CD10⁺-клеток нет. Это означает, что CD34⁺CD10⁺-клетки морфологически не явля­ются преимущественно бластами или крупными предшественниками.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Детальный анализ морфологии гематогонов нормального КМ затруднен из-за их малого количества. Большая часть данных о морфологии гематогонов была получена на образцах КМ пациентов с их реактивным увеличением, поэтому прежде всего необходимо было проверить, можно ли экстраполировать эти данные на нормальный КМ. Анализ гематогонов в мазках КМ дополнительно осложняется неопределенностью в отнесении некоторых клеток незрелой морфологии к гематогонам, а не к миелоидным или Т-клеточным предшествен­никам. В данной работе проведен морфологический анализ чистой популяции гематогонов, выделенных как Сй10⁺-фракция мононуклеарных клеток КМ, с помощью биочипа с иммобилизованными антителами к CD и выполнено сравнение результатов, полученных у пациентов с повышенным содержанием гематогонов и у здоровых доноров. Следует отметить, что в данном исследовании все пациенты с повышенным уровнем гематогонов были младше 2 лет, так как реактивное повышение гематогонов гораздо чаще наблюдается у маленьких детей, в то время как здоровые доноры намного старше.

По своим морфологическим особенностям гематогоны в нормальном КМ делятся на 2 категории: бласты диаметром 13-17 мкм с кружевным или тонкосеточным хроматином и одним или несколькими ядрышками и незрелые лимфоидные клетки с очень высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением, нежным рисунком хроматина и отсутствием ядрышек. Небольшая часть клеток последнего морфологического типа имеет диаметр 10-15 мкм и отнесена нами к предварительной категории «крупные предшественники». Стоит отметить, что гематогоны с бластной морфологией по некоторым морфологическим критериям [26] имеют много общих черт с миелоидными бластами, поэтому их нелегко идентифицировать в качестве предшественников В-клеток в мазках КМ.

Фракции CD10⁺-мононуклеаров с бластной морфологией и крупных предшественников в нормальном КМ и КМ пациентов с повышенным процентом гематогонов существенно не различаются, и у пациентов не было обнаружено новых морфологических типов предшественников В-клеток. Эти данные оправдывают использование образцов с повышенным содержанием гематогонов для их морфологического исследования. Доля крупных предшественников в общей популяции В-клеток (CD19+) была значительно меньше у пациентов с повышенным содержанием гематогонов по сравнению со здоровыми донорами. Это может быть объяснено тем фактом, что процент зрелых sIgM+ В-клеток при реактивном увеличении гематогонов также растет (рисунок 1).

Увеличение количества sIgM+ В-клеток одновременно с ростом количества гематогонов является одним из признаков, отличающих реактивное увели­чение гематогонов от В-ОЛЛ, поскольку это показывает отсутствие характерного для В-ОЛЛ блока дифференцировки В-клеток [11, 15]. Хотя среднее процентное содержание CD20+- и CD22⁺-клеток в аспиратах КМ здоровых доноров и пациентов с повышенным уровнем гематогонов было одинаковым (рисунок 1), у некоторых пациентов с повышенным уровнем гематогонов оно было выше, чем у здоровых доноров. Эта разница не связана с возрастом, так как процент CD20⁺-клеток в КМ, напротив, с возрастом увеличивается [25]. Поскольку процентное содержание CD20+- и CD22⁺-клеток с бластной морфологией и крупных предшественников у некоторых пациентов выше, чем в контрольной группе, это может указывать на то, что увеличение популяций этих двух видов клеток, по крайней мере, частично обусловлено увеличением количества гематогонов.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Самый интересный вопрос заключается в том, существует ли корреляция между морфологией гематогонов и стадией их созревания. Мы частично ответили на этот вопрос, проанализировав распреде­ление по размерам CD34⁺CD10⁺-клеток, что соответствует 1-й стадии созревания гематогонов. Показано, что диаметр CD34⁺-клеток изменяется в пределах от 7 до 14 мкм и, следовательно, морфологически они не относятся исключительно к бластам или крупным предшественникам (рисунок 4В). С другой стороны, некоторые клетки, положительные по CD20 - маркеру, который отсутствует на поверхности В-клеток до 2-й стадии созревания гематогонов, также имеют бластную морфологию (рисунок 3А). Таким образом, корреляции между морфологией и стадией созревания гематогонов не обнаружено. Поскольку нормальные предшественники В-клеток продолжают пролиферировать до стадии малых пре-В-клеток, на которой начинается перестройка легких цепей иммуноглобулинов [27, 28], можно предположить, что разница в морфологии отражает положение клетки в клеточном цикле, а не стадию ее созревания.

 

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа частично поддержана грантом Российского научного фон­да №23-45-10039 (https://rscf.ru/en/project/23-45-10039/).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

ORCID

Zakirova А.О. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9475-3318

Fedyanina О.S. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7131-8006

Khvastunova AN. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7117-0168

Filatov A.V. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6460-9427

Kuznetsova SA ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5946-0026

About the authors

Anna O. Zakirova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: no-reply@eco-vector.ru
ORCID iD: 0000-0001-9475-3318
Russian Federation, Moscow, Russia; Moscow, Russia

Maria V. Kormilitsina

Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University)

Email: no-reply@eco-vector.ru
Russian Federation, Moscow, Russia

Olga S. Fedyanina

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: no-reply@eco-vector.ru
ORCID iD: 0000-0001-7131-8006
Russian Federation, Moscow, Russia; Moscow, Russia

Anna N. Khvastunova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: alina_shunina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7117-0168
Russian Federation, Moscow, Russia; Moscow, Russia

Alexander V. Filatov

National Research Center “Institute of Immunology” of the Federal Medical Biological Agency of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: no-reply@eco-vector.ru
ORCID iD: 0000-0002-6460-9427
Russian Federation, Moscow, Russia

Sophia A. Kuznetsova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: kuznetsova.sonya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5946-0026
Russian Federation, Moscow, Russia; Moscow, Russia

References

Supplementary files