Detection of phosphatidylserine-expressing red blood cells in whole blood

Full Text

Эритроциты - самые распространенные клетки крови человека, их основной задачей является доставка кислорода ко всем клеткам тела. Гемоглобин, занимающий до 80% объема клетки, является токсичным для внутренних органов белком, в связи с чем предотвращение его высвобождения вследствие внутрисосудистого лизиса представляет собой важный вопрос. Другой причиной убрать эритроциты из кровотока до их окончательной смерти является нарушение способности «старых» клеток к изменению формы и, как следствие, возможность застревания в капиллярах [1]. Основную роль в их элиминации отводят селезенке - лимфоидному органу, который содержит ретикуло-эндотелиальную систему, ответственную за клиренс эритроцитов. Но каким образом селезенке удается элиминировать все клетки, которые могут погибнуть в ближайшее время? Могут ли эритроциты в стадии гибели циркулировать в общем кровотоке?

Считается, что решающую роль в клиренсе эритроцитов играет их фильтрация через особые ходы в селезенке, которые имитируют крайне узкие капилляры [1, 2]. В ходе старения эритроцит теряет способность менять свою форму [3] и в конце концов застревает там. У данной гипотезы есть ряд недостатков. Так, в экспериментах на мышиных моделях было продемонстрировано, что элиминация эритроцитов замедляется при нокауте по лактадхерину (белок, способный связываться с фосфатидил- серином на поверхности клетки и опосредовать фагоцитоз) [4, 5]. Другое важное замечание (чисто математический расчет) - через селезенку в час проходит около 9 л крови, что приблизительно составляет 2 объема циркулирующей крови (ОЦК), однако до 90% этого объема проходит сквозь «закрытую» систему кровотока, в которой фильтрации сквозь ретикулоэндотелиальную систему не происходит. Несложно посчитать, что характерное время фильтрации 1 ОЦК через «открытую» систему, где и происходит клиренс, составит примерно 5 ч. Возможно, что некоторые эритроциты могут не попа­дать туда в течение и более длительного времени.

Таким образом, для того чтобы в кровотоке не было ни одного эритроцита в «мертвом» или «прак­тически мертвом» состоянии, необходима система, элиминирующая их за несколько часов до теоретически возможной смерти с достаточно высокой степенью точности и, что немаловажно, специфичности. Данная задача представляется достаточно тяжелой, однако на сегодняшний день в крови здоровых доноров в ряде исследований достоверно не было детектировано ни одного «мертвого» эритроцита с достаточной степенью уверенности, чтобы не считать это проблемой метода (оценка спустя длительное время - 24-48 ч, определение эритроцитов после центрифугирования цельной крови в плазме, богатой тромбоцитами [6] и др.), но специа­листы верят в их существование [3, 7-9]. А что такое «мертвый» или «практически мертвый» эритроцит? Основываясь на каких параметрах можно так сказать о клетке, у которой нет ни ядра, ни митохондрии?

Всего около 20 лет назад появилось и в дальнейшем закрепилось такое понятие, как «эриптоз», или запрограммированная гибель эритроцита [10]. Она характеризуется, во-первых, нарушением мембранной асимметрии - появлением фосфатидил- серина на внешней мембране эритроцита, во-вторых, уменьшением объема клетки и, в-третьих, образова­нием микровезикул [10-12]. Данные признаки характерны и для апоптоза ядерных клеток. Для детекции эриптоза может быть использована проточная цито- флуориметрия, позволяющая оценивать форму/ размер (через прямое (FSC) и боковое (SSC) свето­рассеяние), а также экспрессию фосфатидилсе- рина на внешней мембране клетки с использованием специальных маркеров.

В данной работе мы приводим собственный протокол проточной цитофлуориметрии для детекции эриптотических эритроцитов в цельной крови.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

Взятие крови

Для исследования выполнялось взятие крови у здоровых добровольцев, подписавших добровольное информированное согласие в соответствии с Хель­синкской декларацией. Работа одобрена незави­симым этическим комитетом и утверждена решением ученого совета ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рога­чева» Минздрава России. Взятие крови проводилось посредством венепункции в вакуумные пробирки с цитратом натрия (3,2%) в качестве антикоагулянта, объем крови во время хранения был не менее 1 мл. Перед анализом допускалось хранение крови до 6 ч при комнатной температуре.

Окрашивание и анализ образцов с помощью проточной цитофлуориметрии

Общая пробоподготовка и окраска подробно представлены в таблице. Цельная кровь для анализа разводилась модифицированным буфером Тироде (150 мМ хлорида натрия, 2,7 мМ хлорида калия, 1 мМ хлорида магния, 0,4 мМ дигидрофосфата натрия, 20 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пипе-разинэтансульфоновая кислота), 5 мМ глюкозы, и 0,5% бычьего сывороточного альбумина; pH 7,4) в 1000 раз. После этого разбавленную кровь инкуби­ровали с маркерами фосфатидилсерина в течение 15 мин в присутствии 2 мМ хлорида кальция. В качестве маркеров использовали рекомбинантный аннексин V собственного производства, конъюгированный с AF647 (Lumiprobe, США), а также рекомбинантный С2-фрагмент лактадхерина с флуоресцентной меткой mNeonGreen собственного производства [13]. Финальные концентрации маркеров фосфатидилсерина были 100 нМ. Для наиболее точного детектирования эритроцитов образцы дополнительно окрашивали антителами к гликофорину А (Elabscience, Китай), время окраски - 5 мин (добавляли через 10 мин от начала инкубации с маркерами фосфатидилсерина), финальное разведение 1:50. Для определения возможного влияния антител на процессы эриптоза также использовали контрольную пробу без окрашивания антителами.

Для аннексина V в качестве контроля была выбрана проба с добавлением аннексина V - AF647 в присутствии ЭДТА (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, хелатор ионов кальция), которая блокирует связывание аннек- сина V с фосфатидилсерином. По данной пробе была проведена граница региона, обозначающего аннексин V-положительные события. Для лактад- херина в качестве контроля была выбрана проба с добавлением рекомбинантного mNeonGreen в концентрации 100 нМ. В качестве положи­тельного контроля для связывания маркеров фосфатидилсерина использовались отмытые эритроциты, обработанные индуктором эриптоза ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат) [14].

 

Таблица. Протокол выполнения проточной цитофлуориметрии

Table. The protocol for flow cytometry

Параметр Parameter	Значение Value
Шаг 1. Разведение цельной крови Step 1. Dilution of whole blood
Буфер Тироде, мкл Tyrode’s buffer, μL	1000
Цельная кровь, мкл Whole blood, pL	1
Шаг 2. Пробоподготовка Step 2. Sample preparation
	Проба 1 Sample 1	Проба 2 Sample 2	Проба 3 Sample 3	Проба 4 Sample 4
Разведенная кровь, мкл Diluted blood, pL	150	150	150	150
Хлорид кальция (100 мМ), мкл Calcium chloride (100 mM), pL	3	3	3	-
ЭДТА (100 мМ), мкл EDTA (100 mM), pL	-	-	-	3
Шаг 3. Окрашивание маркерами фосфатидилсерина Step 3. Staining with phosphatidylserine markers
Аннексин V - AF647 (5 мкМ), мкл Annexin V - AF647 (5 pM), pL	3	3	-	3
Лактадхерин - mNeonGreen (10 мкл), мкл Lactadherin - mNeonGreen (10 pL), pL	1,5	1,5	-	-
mNeonGreen (10 мкМ), мкл mNeonGreen (10 pM), pL	-	-	1,5	-
Инкубация, мин Incubation, min	10	10	10	10
Шаг 4. Окрашивание антителами Step 4. Staining with antibodies
Антитела к CD235a, мкл Antibodies to CD235a, pL	-	3	-	-
Инкубация, мин Incubation, min	5	5	5	5
Шаг 5. Измерение на проточном цитофлуориметре Step 5. Flow cytometry

 

Готовые образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD Biosciences, США) при средней скорости потока, дополнительное разведение перед измерением не проводилось. Общее число событий в пробе для анализа - не менее 150 000, число событий в регионе эритроцитов - не менее 120 000.

Обработка цитофлуориметрических данных

Обработка цитофлуориметрических данных проводилась в соответствии со схемой, представ­ленной на рисунке 1. Для пробы без антител к CD235a регион эритроцитов выделялся с использованием плота FSC/SSC. Для пробы с добавлением антител регион эритроцитов выделялся по плоту FSC/CD235a, что в дальнейшем позволяет (и может быть особенно актуально для отдельных пациентов) при использовании плота FSC/SSC выделять регион эритроцитов с сохранной и измененной формой. Кроме того, представлены стратегии гейтирования для маркеров фосфатидилсерина.

Статистический анализ

Статистическая обработка результатов проточной цитофлуориметрии проводилась с использованием программного обеспечения Origin 2018b (OriginLab Corporation, США). Для сравнения долей фосфатидилсерин-положительных эритроцитов в зависимости от используемого маркера применялся диспер­сионный анализ (ANOVA) с пост-хок t-критерием методом Бонферрони. Для анализа влияния антител на уровень фосфатидилсерин-положительных эритроцитов использовался U-критерий Манна- Уитни. Отличия считались статистически достовер­ными при значении р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

С учетом литературных данных об особенностях анализа эритроцитов в норме и в стадии эриптоза был разработан метод цитофлуориметрического исследования цельной крови с детекцией эриптоти- ческих клеток с использованием 2 разных маркеров фосфатидилсерина - лактадхерина и аннексина V. Несмотря на то, что традиционным маркером фосфатидилсерина является именно аннексин V, по литера­турным данным, лактадхерин - более чувствительный маркер [15], в связи с чем он был выбран в качестве возможной альтернативы. При использовании антител удалось выявить субпопуляцию с измененными параметрами FSC и SSC (рисунок 1Д), до половины данной субпопуляции связывает лактадхерин, что указывает на процессы клеточной смерти, которая сопровожда­ется потерей дискоидной формы. Однако, учитывая малое число этих событий, их достоверный анализ затруднен.

Используя разработанную методику, мы проанализировали циркулирующие эритроциты крови здоровых доноров, выявили кратное увеличение доли фосфатидилсерин-положительных эритроцитов при использовании в качестве маркера фосфатидилсерина лактадхерин (рисунок 2). Данные группы при дисперсионном анализе достоверно отличались друг от друга. Что интересно, при анализе пост-хок выяви­лось лишь достоверное отличие (р < 0,05) группы лактадхерина от остальных, в то время как остальные группы не отличались друг от друга (р > 0,05).

При сравнительном анализе влияния антител на процент эриптотических эритроцитов была продемонстрирована зависимость изменения процента клеток, экспрессирующих фосфатидилсерин, от используемого маркера. Так, отличие, видимое при использовании лактадхерина, оказалось статистически незначимым (p = 0,063) (рисунок 3А), в то время как при использовании в качестве маркера аннексина V выявлено достоверное увеличение процента в пробе с добавлением антител (p = 0,015) (рисунок 3Б). В качестве положительного контроля использовались эритроциты, обработанные ФМА. Как представлено на рисунке 4, оба маркера позволяют выявлять фосфатидилсерин-экспрессирующую субпопуляцию в условиях стимуляции эриптоза.

 

Рисунок 1. Стратегия гейтирования эритроцитов и выделения регионов фосфатидилсерин-экспрессирующих субпопуляций

В качестве образца для анализа использовалась цельная кровь, разведенная в 1000 раз буфером Тироде. Сверху приведены гейты для региона эритроцитов по плоту FSC/SSC (А), для клеток внутри выделенного региона в целях определения доли фосфатидилсерин-экспрессирующих субпопуляций для лактадхерина (Б) и аннексина V (В). Снизу представлены гейты для региона эритроцитов по плоту FSC/CD235a (проба, окрашенная антителами к гликофорину А) (Г), для событий внутри этого региона в целях выделения клеток сохранной и измененной формы по данным плота FSC/SSC (Д), а также выделение фосфатидилсерин-экспрессирующей субпопуляции с использованием лактадхерина (Е)

Figure 1. A strategy for red blood cell gating and identification of regions of phosphatidylserine-expressing subpopulations

A sample of whole blood diluted a 1000 times in Tyrode's buffer was utilized. The upper row of images shows gates for a region of RBCs in the FSC/SSC plot (А), for cells within the selected region for determination of the proportion of phosphatidylserine-expressing subpopulations when using lactadherin (Б) or annexin V (В). The lower row of images shows gates for a region of RBCs in the FSC/CD235a plot (a sample stained with antibodies to glycophorin A) (Г), for events within this region for identification of cells of normal and altered shape as per the FSC/SSC plot data (Д) as well as for identification of a phosphatidylserine-expressing subpopulation using lactadherin (E)

 

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Применение методов проточной цитофлуориметрии для выявления эритроцитов в стадии эриптоза в цельной крови сопряжено с рядом трудностей.

Описанные в литературе методы используют для детекции продолжительное (зачастую более суток) время предварительной инкубации ex vivo, относительно жесткие режимы центрифугирования, что усложняет интерпретацию данных [16].

Приведенный в данной работе протокол позволяет обойти вероятную проблему в детекции эриптоза - низкие количества экспрессируемого фосфатидил-серина на ранних стадиях за счет использования более чувствительного маркера [15]. Что еще более интересно, приведенные результаты показывают, что, по крайней мере, на малой выборке не продемонстрировано статистически значимого различия между процентом аннексин V-связывающих клеток в пробе и контроле. В то же время лактадхерин показывал достоверное отличие процента фосфатидилсерин-положительных клеток в сравнении и с контролем, и с пробой с аннексином V.

 

 

Рисунок 2

Процент эриптотических клеток в зависимости от используемого маркера фосфатидилсерина

Представлены диаграммы размаха с исходными данными результатов проточной цитофлуориметрии разведенной цельной крови с определением доли фосфатидилсерин-экспрессирующих клеток в регионе эритроцитов по данным плота FSC/SSC. Приведены результаты для лактадхерина, аннексина V и их парных контролей - mNeonGreen и аннексина V в присутствии ЭДТА (этилендиаминтетраацетат). Зафиксировано отличие в дисперсионном анализе, по результатам пост-хок теста Бонферрони доля клеток, окрашенных лактадхерином, достоверно отличалась от остальных методов окраски (p < 0,05). Результаты остальных методов достоверно не отличались друг от друга. Представлены данные для 6 здоровых доноров

Figure 2

The percentage of eryptotic cells according to the utilized phosphatidylserine marker

Box plots based on the initial results of flow cytometry of diluted whole blood with determination of the proportion of phosphatidyl- serine-expressing cells in the region of RBCs as per the FSC/SSC plot data. The graph demonstrates results for lactadherin, annexin V and their matched controls - mNeonGreen and annexin V with EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid). There were differences in the analysis of variance, and according to the results of a post-hoc Bonferroni test, the proportion of lactadherin-stained cells differed significantly from other staining methods (p < 0.05). The results of testing using other methods were not significantly different. The graph shows data for 6 healthy donors

 

 

Рисунок 3. Изменение количества эриптотических клеток в зависимости от наличия антиэритроцитарных антител

А - представлены диаграммы размаха с исходными данными для доли лактадхерин-связывающих клеток в регионе эритроцитов для пробы с добавлением антител и без них. Статистически значимого различия при использовании крите­рия Манна-Уитни не выявлено (p= 0,063); Б - приведены аналогичные диаграммы размаха для аннексина V в качестве маркера фосфатидилсерина. Отмечен статистически достоверный прирост числа аннексин V-положительных событий при использовании антител (p= 0,015). Результатыприведеныдля 6 здоровыхдоноров

Figure 3. The number of eryptotic cells based on the presence/absence of anti-RBC antibodies

A - box plots with the initial data on the proportion of lactadherin-binding cells in the region of RBCs in a sample with/without antibodies. The Mann-Whitney U test did not reveal any significant differences (p = 0.063); Б - similar box plots for annexin V used as a phosphatidylserine marker. A significant rise in the number of annexin V-positive events was registered when using antibodies (p = 0.015). The graph shows data for 6 healthy donors

А	Б

 

Другим важным аспектом цитофлуориметрического анализа является использование антител. Однако антитела к эритроцитам известны своей способностью вызывать их агглютинацию и, возможно, повреждение, что также было подтверждено в данном исследовании для антител к гликофорину А (CD235a) [17]. Данное влияние было более заметно при использовании традиционного, менее чувствительного маркера фосфатидилсерина - аннексина V (рисунок 3). Таким образом, логичным выводом может стать мысль об ускорении процессов смерти эритроцитов в присутствии антител в первую очередь для тех клеток, которые уже находятся «на грани». Это утверждение является гипотезой и требует дальнейших исследований.

 

Рисунок 4. Связывание маркеров фосфатидилсерина интактными эритроцитами и эритроцитами, стимулированными ФМА

На гистограммах представлены результаты окраски маркерами фосфатидилсерина отмытых эритроцитов (голубой цвет) и эритроцитов, обработанных индуктором эриптоза ФМА (розовый цвет). На панели А представлены результаты окрашивания лактадхерином, на панели Б - аннексином V. Оба маркера позволяют выявлять субпопуляцию фосфатидилсерин-экспрессирующих событий

Figure 4. The binding of phosphatidylserine markers by intact and PMA-stimulated RBCs

The histograms show the results of staining with phosphatidylserine markers performed on washed red blood cells (blue) and red blood cells treated with an eryptosis inductor (PMA) (pink). Panel A demonstrates the results of staining with lactadherin, panel B - the results of staining with annexin V. Both markers can be used to detect a subpopulation of phosphatidylserine-expressing events

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе был разработан и апробирован новый протокол детекции эриптотических эритроцитов с использованием метода проточной цитофлуориметрии, который позволяет обнаруживать такие клетки в цельной крови здоровых доноров. Проведен сравнительный анализ 2 известных маркеров фосфатидилсерина - аннексина V и лактадхерина, в ходе которого продемонстрирована способность послед­него к более точной детекции таких клеток. Важным методическим результатом данной работы явля­ется идея использования одновременно 2 маркеров фосфатидилсерина и необходимость наличия проб как с использованием антиэритроцитарных антител, так и без них, с учетом их влияния на эритроциты.

 

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа поддержана грантом Российского научного фонда №23-75-10120.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

 

Chabin I.A. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0625-1743

Podoplelova N.A. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8013-1112

Koltsova E.M. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0167-6726

Butov K.R. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4664-6953

Obydennyi S.I. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2930-8768

Smetanina N.S. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-2756-7325

Panteleev M.A. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-8128-7757

About the authors

Ivan A. Chabin

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: ivan.chabin@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0003-0625-1743
Russian Federation, Moscow, Russia

N. A. Podoplelova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: podoplelovan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8013-1112
Russian Federation, Moscow, Russia; Moscow, Russia

Ekaterina M. Koltsova

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: ekaterina_koltsova@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-0167-6726
Russian Federation, Moscow, Russia; Moscow, Russia

Kirill R. Butov

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: no-reply@eco-vector.ru
ORCID iD: 0000-0002-4664-6953
Russian Federation, Moscow, Russia; Moscow, Russia; Moscow, Russia

Sergei I. Obydennyi

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: obydennyj@physics.msu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2930-8768
Russian Federation, Moscow, Russia; Moscow, Russia

Nataliya S. Smetanina

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology

Email: Nataliya.Smetanina@dgoi.ru
ORCID iD: 0000-0003-2756-7325

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow, Russia

Mikhail A. Panteleev

Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; Center for Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University, Moscow

Author for correspondence.
Email: mapanteleev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8128-7757

Corresponding Member of the RAS, Dr. Sci. (Physics and Mathematics), Professor

Russian Federation, Moscow, Russia; Moscow, Russia; Moscow, Russia

References

Supplementary files